Allitinib tosylate EGFR inhibiteur

AST-1306 est également un double mutant ErB2 et EGFR T790M/L858R. L'AST-1306 est environ 500 fois plus puissant que le lapatinib et plus de 3000 fois plus sélectif pour les kinases de la famille ErbB que pour d'autres familles de kinases, y compris PDGFR, KDR et c-Met. L'AST-1306 pourrait se lier de manière covalente à des résidus d'acides aminés spécifiques de l'EGFR et de l'ErbB2. L'AST-1306 agit de manière dépendante de la concentration pour inhiber significativement la croissance des cellules HIH3T3-EGFR T790M/L858R. L'AST-1306 supprime efficacement la phosphorylation de l'EGFR dans les cellules HIH3T3-EGFR T790M/L858R. De plus, l'AST-1306 bloque la croissance des cellules NCI-H1975 qui abritent la mutation EGFR T790M/L858R de manière dépendante de la concentration. L'AST-1306 bloque également la phosphorylation de l'EGFR et des voies en aval. En outre, l'AST-1306 inhibe de manière dose-dépendante et marquée la phosphorylation de l'EGFR induite par l'EGF dans les cellules A549. L'AST-1306 inhibe la phosphorylation de l'EGFR et de l'ErbB2, et la signalisation en aval dans les cellules cancéreuses humaines, y compris les cellules A549, les cellules Calu-3 et les cellules SK-OV-3. [1]

Essais de tyrosine kinase

Les activités des tyrosine kinases sont déterminées dans des plaques ELISA à 96 puits pré-enduites de 20 μg/mL de Poly (Glu,Tyr)4:1. Premièrement, 80 μL de solution d'ATP 5 μM diluée dans un tampon de réaction de kinase (50 mM HEPES pH 7,4, 20 mM MgCl₂, 0,1 mM MnCl₂, 0,2 mM Na₃VO₄, 1 mM DTT) sont ajoutés à chaque puits. Diverses concentrations d'AST-1306 diluées dans 10 μL de 1% de DMSO (v/v) sont ensuite ajoutées à chaque puits de réaction, avec 1% de DMSO (v/v) utilisé comme contrôle négatif. Par la suite, la réaction de kinase est initiée par l'ajout de protéines tyrosine kinase purifiées diluées dans 10 μL de solution de tampon de réaction de kinase. Les expériences à chaque concentration sont effectuées en double. Après incubation pendant 60 min à 37 °C, la plaque est lavée trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,1% de Tween 20 (T-PBS). Ensuite, 100 μL d'anticorps anti-phosphotyrosine (PY99, dilution 1:500) dilués dans du T-PBS contenant 5 mg/mL de BSA sont ajoutés. Après 30 min d'incubation à 37 °C, la plaque est lavée trois fois comme précédemment. L'IgG de chèvre anti-souris conjuguée à la peroxydase de raifort (100 μL) diluée 1:2000 dans du T-PBS contenant 5 mg/mL de BSA est ajoutée. La plaque est réincubée à 37 °C pendant 30 min, puis lavée avec du PBS. Enfin, 100 μL d'une solution contenant 0,03% de H2O2 et 2 mg/mL d'o-phénylènediamine dans un tampon citrate 0,1 M, pH 5,5, sont ajoutés et les échantillons sont incubés à température ambiante jusqu'à l'apparition de la couleur. La réaction est terminée par l'ajout de 50 μL de H2SO4 2 M, et la plaque est lue à l'aide d'un spectrophotomètre multi-puits à 490 nm. Le taux d'inhibition (%) est calculé à l'aide de l'équation suivante: [1-(A490 traité /A490 contrôle)] ×100%. Les valeurs d'IC50 sont déterminées à partir des résultats d'au moins trois tests indépendants et calculées par la méthode Logit.

L'administration orale d'AST-1306 deux fois par jour entraîne une prévention spectaculaire de la croissance tumorale dans les modèles de xénogreffe SK-OV-3 et Calu-3. Dans les modèles SK-OV-3, les tumeurs disparaissent presque complètement après un traitement par AST-1306 pendant 7 jours. En revanche, l'AST-1306 n'inhibe que légèrement la croissance tumorale dans les modèles de xénogreffe HO-8910 et A549. Par conséquent, l'efficacité antitumorale de l'AST-1306 est plus grande dans les modèles tumoraux surexprimant ErbB2 que dans les modèles exprimant de faibles niveaux d'ErbB2. L'AST-1306 est bien toléré. Le lapatinib présente une activité antitumorale dans ces modèles tumoraux surexprimant ErbB2, mais l'AST-1306 est plus efficace que le lapatinib dans le modèle de tumeur xénogreffe SK-OV-3 lorsqu'il est administré à la même dose et selon le même schéma. De plus, l'administration orale d'AST-1306 deux fois par jour pendant 3 semaines supprime de manière spectaculaire la croissance tumorale dans les modèles FVB-2/N^neu. Après 11 jours de traitement, les tumeurs disparaissent presque complètement. Le poids corporel des souris diminue de moins de 20% pendant le traitement. [1]