NMS-873 p97 remmer

The most potent and specific p97 inhibitor described to date.

NMS-873 vermindert de p97-gevoeligheid voor trypsinevertering, waardoor afbraak van het linker-D2-domein wordt voorkomen. Deze verbinding, als p97-remmer, produceert antiproliferatieve activiteit in een verscheidenheid aan hematologische en solide tumorlijnen. De mechanische studie geeft aan dat deze chemische stof de ontvouwen eiwitrespons activeert, interfereert met autofagie en zo de dood van kankercellen induceert. [1]

Ontwikkeling van biochemische assays en HTS

De ATPase-activiteit en de kinetische parameters van recombinant wildtype VCP en zijn mutanten worden geëvalueerd door ADP-vorming in de reactie te monitoren, met behulp van een gemodificeerde NADH-gekoppelde assay. Aangezien ADP en NADH ATP-competitieve remmers zijn van VCP ATPase-activiteit, wordt het standaardprotocol voor de NADH-gekoppelde assay aangepast tot een tweestapsprocedure. In het eerste deel recyclet een ATP-regenererend systeem (40 U/ml pyruvaatkinase en 3 mM fosfoenolpyruvaat) het ADP dat door VCP-activiteit wordt geproduceerd, houdt de substraatconcentratie constant (waardoor productremming wordt voorkomen) en accumuleert een stoichiometrische hoeveelheid pyruvaat. In het tweede deel wordt de VCP-enzymatische reactie geblust met 30 mM EDTA en 250 μM NADH en stoichiometrisch geoxideerd door 40 U/ml melkzuurdehydrogenase om geaccumuleerd pyruvaat te reduceren. De afname van de NADH-concentratie wordt gemeten bij 340 nm met behulp van een Tecan Safire 2-lezerplaat. De assay wordt uitgevoerd in 96- of 384-wells UV-platen in een reactiebuffer met 50 mM Hepes, pH 7,5, 0,2 mg/ml BSA, 10 mM MgCl₂ en 2 mM DTT. Experimentele gegevens worden gefit met een coöperatieve vergelijking, waarbij een Ks* van ongeveer 60 μM en een Hill-coëfficiënt (n) van 2,0 ± 0,1 worden verkregen. De HTS-campagne wordt uitgevoerd tegen een bibliotheek van 1 miljoen verbindingen met behulp van een geminiaturiseerde assay in 1.536-wells formaat en een gevoeliger ADP-detectiesysteem, Transcreener ADP FP. Een pre-incubatie van 20 minuten van 10 nM VCP en 10 μM remmer wordt uitgevoerd, waarna 10 μM ATP aan de reactie wordt toegevoegd, die 90 minuten mag doorgaan voordat deze wordt geblust. De gemiddelde Z′ van de screening is 0,58, en de hitrate met 3× s.d. (38% remming) als cutoff is 1,7%. Primaire hits met >60% remming bij een concentratie van 10 μM worden gesnoeid met behulp van fysiochemische en structurele filters, waardoor 7.516 verbindingen overblijven. Uiteindelijk wordt reconfirmatie in duplo uitgevoerd op 3.988 primaire hits, en 500 verbindingen worden geselecteerd voor een dosis-respons evaluatie met behulp van de eerder beschreven NADH-gemodificeerde gekoppelde assay. De potentie van de meest interessante HTS-hits wordt gemeten tegen zowel wildtype VCP als de C522T-mutant. ATP-concentraties die de halfmaximale snelheid (Ks*) opleverden voor elk enzym, overeenkomend met 60 μM en 130 μM voor respectievelijk het wildtype en de C522T-mutant, worden in de assay gebruikt. Om de afhankelijkheid van reversibele remmers van substraatconcentratie te onderzoeken, wordt hun potentie ook geëvalueerd bij verzadigende ATP-concentratie (1 mM) en vergeleken met de potentie van een standaard ATP-competitieve remmer (AMP-PNP).