Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

Benodigde materialen (niet inbegrepen)

• microplaatlezer (450 nm filter)
• 10 μl, 100-200 μl en meerkanaalspipetten.
• 1 % SDS (optioneel).

Experimentele procedure

1) Ent cellen in een celkweekfles of -schaal en laat de cellen ongeveer 4–24 uur hechten of groeien voordat u verdergaat met de assay.
2) Voeg 1/10 volume Cell Counting Kit-8 (CCK-8) direct toe aan de cellen in het kweekmedium. Meng grondig om een homogene oplossing te verkrijgen door lichtjes op de buitenkant van de plaat te tikken, terwijl u bellen vermijdt. Voor een 96-wells plaat voegt u 10 µl Cell Counting Kit-8 (CCK-8) toe per 100 µl kweekmedium.
3) Incubeer in een celkweekincubator gedurende 0,5 tot 4 uur bij 37°C totdat de kleur oranje wordt. Te lang incuberen geeft valse resultaten.
Opmerking: De detectiegevoeligheid neemt toe bij langere incubatietijden. Voor monsters met minder cellen, gebruik een langere incubatietijd van maximaal 24 uur.
4) Registreer de resultaten met behulp van een microplaatlezer om de absorptie van Cell Counting Kit-8 (CCK-8) bij 450 nm te meten. Aanbevolen OD-waarden liggen tussen 0,8-1,5, maar waarden tussen 0,5-2,5 zijn acceptabel.
Opmerking: Een lichte spontane absorptie rond 450 nm treedt op in kweekmedium geïncubeerd met Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Deze achtergrondabsorptie is afhankelijk van het kweekmedium, de pH, de incubatietijd en de duur van de blootstelling aan licht. Typische achtergrondabsorptie na 2 uur incubatie is 0,1 - 0,2 absorbantie-eenheden. Om dit te corrigeren, bereidt u een of meer controlewells zonder cellen voor en trekt u de gemiddelde absorptie van de controlewells af van die van de andere wells.
5) Optioneel: Voeg 10 μl 1% SDS (los 0,1 g SDS op met PBS-buffer om 10 ml oplossing te bereiden) rechtstreeks toe aan 100 μl cellen om de reactie te stoppen. Signalen kunnen binnen 3 dagen worden afgelezen zonder de absorptiewaarden te beïnvloeden.
6) Berekening van cellevensvatbaarheid:
Cellevensvatbaarheid (%)
A (Drug+): OD-waarde van wells met cellen, CCK-8 en medicijnen;
A (Drug-): OD-waarde van wells met cellen, CCK-8, maar zonder medicijnen;
A (Leeg): OD-waarde van wells met kweekmedium en CCK-8, maar zonder cellen.

Korte samenvatting van het protocol

Toepassingen

1) Bepalingen van celproliferatie – de Selleck Cell Counting Kit-8 (CCK-8) is wateroplosbaar, stabiel in kweek en niet-toxisch.
2) Cellevensvatbaarheidsassays – metabole activiteit en kleurstofgeneratie veranderen evenredig met de veranderde levensvatbaarheid.
3) Cytokine-assays – meten cytokine-geïnduceerde proliferatie. Cellen kunnen aan het einde van de studie, indien gewenst, worden teruggewonnen en uitgebreid.
4) Cytotoxiciteitsassays – celdood door cytotoxische chemicaliën heeft geen effect op kleuring; alleen levende cellen zetten het reagens om in een colorimetrische indicator. Het reagens zelf heeft een verwaarloosbare toxiciteit en is over het algemeen veilig voor cellen.

Opmerking

1. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) is een gebruiksklare oplossing. Meng het reagens om een homogene oplossing te garanderen voor gebruik.
2. Als u van plan bent een langere incubatietijd (overnacht) te gebruiken, zorg er dan voor dat u steriele omstandigheden handhaaft tijdens de toevoeging van het reagens en de incubatie om microbiële verontreinigingen te voorkomen. Gecontamineerde culturen zullen foutieve resultaten opleveren, aangezien microbiële verontreinigingen ook de Cell Counting Kit-8 (CCK-8) reduceren.
3. Zorg ervoor dat u geschikte assaycontroles opneemt. Om experimentele fouten te minimaliseren, raden we aan om metingen uit te voeren van minimaal 3-8 replicaten van de experimentele en medium-alleen controle.
4. Dit product is uitsluitend voor R&D-gebruik, niet voor medische, huishoudelijke of andere toepassingen.