NVP-BVU972 c-Met inhibiteur

NVP-BVU972 inhibe puissamment la kinase MET mais montre une faible inhibition contre d'autres kinases, y compris la kinase RON, la plus étroitement liée, avec des valeurs IC50 supérieures à 1000 nM. Ce composé supprime également la phosphorylation constitutive de MET dans les cellules GTL-16 ou la phosphorylation de MET stimulée par HGF dans les cellules A549 avec des valeurs IC50 de 7,3 nM et 22 nM, respectivement. Il empêche puissamment la croissance des lignées cellulaires amplifiées par le gène MET GTL-16, MKN-45 et EBC-1 avec des valeurs IC50 de 66 nM, 82 nM et 32 nM, respectivement. Conformément à leur fréquence élevée dans ce criblage de composés, les mutations Y1230 et D1228 entraînent des décalages dramatiques des valeurs IC50 mesurées pour celui-ci dans la lignée cellulaire BaF3. La résistance déclenchée par V1155L est plus limitée à ce produit chimique. Une réduction dose-dépendante de la phosphorylation de TPR-MET lors de son application aux cellules BaF3 exprimant le TPR-MET de type sauvage. Les mutations Y1230H et D1228A ont toutes deux abrogé l'effet de ce composé mais pas celui d'AMG 458. Cependant, F1200I et L1195V interfèrent avec sa puissance pour empêcher la phosphorylation de TPR-MET.[1]

Essai biochimique TR-FRET avec MET de type sauvage et mutants

L'activité enzymatique est mesurée par un essai de transfert d'énergie par résonance de fluorescence résolue dans le temps (TR-FRET), détectant la phosphorylation de la tyrosine avec un anticorps anti-phospho-tyrosine marqué à l'Eu (donneur de fluorescence) et de l'Allophycocyanine conjuguée à la Streptavidine (accepteur de fluorescence) qui se lie à une biotine sur le peptide substrat. Pour chaque variant, les concentrations K_m d'ATP sont déterminées en l'absence de ce composé, et la concentration d'ATP dans la réaction de la kinase est fixée à K_m (4 μM pour MET wt, 1 μM pour MET Y1230H et MET F1200I). Il est dissous et dilué dans du DMSO et testé en quadruplicata. Les réactions de la kinase sont effectuées dans 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 8 mM MgCl₂, 4 mM MnCl₂, 0,05 % Tween 20, 0,05 % d'albumine sérique bovine, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mM Na₃VO₄, dans des plaques blanches de 1536 puits à température ambiante. Ce produit chimique et l'enzyme sont incubés dans un volume de 2 μL pendant 20 min, suivi de l'ajout de 1 μL d'ATP et de 1 μL de peptide substrat biotinylé (PTK1) à des concentrations finales de K_m et 1 μM, respectivement. Les concentrations d'enzyme dans les réactions sont de 5 nM pour MET wt, et de 4 nM pour les variants F1200I et Y1230H. Après 90 min, les réactions sont arrêtées par l'ajout de 1 μL de solution d'arrêt/détection pour atteindre des concentrations finales de 10 mM EDTA, 3,5 nM d'anticorps anti-phospho-tyrosine PY20 marqué à l'Eu, et 10 nM de Streptavidine Allophycocyanine. Le transfert d'énergie par résonance de fluorescence résolue dans le temps est mesuré dans un lecteur de plaques Envision (excitation 320 nm, émission 615 nm et 665 nm).