Fiche technique

Description biologique

Spécificité	Thrombospondin 1 Antibody [N18C17] détecte les niveaux endogènes de la protéine Thrombospondin 1 totale.
Contexte	La thrombospondine-1 (TSP-1 ou THBS1) est une glycoprotéine matricellulaire homotrimérique sécrétée par les plaquettes, les cellules endothéliales et les fibroblastes, et s'intègre dans la matrice extracellulaire pour réguler le remodelage tissulaire via un large éventail d'interactions ligandiques. La TSP-1 est constituée d'un domaine globulaire N-terminal TSPN qui forme un sandwich β de 13 brins antiparallèles avec un segment β4′ irrégulier distinctif et une liaison disulfure au niveau de la Cys248, permettant la liaison à l'héparine, à l'agrécane et à l'intégrine αvβ3. Cela est suivi d'un domaine C du facteur de von Willebrand, de trois répétitions de type I (TSRs) caractérisées par des échelles de tryptophane/arginine empilées et des motifs WXXWCSXG conservés qui médient l'engagement avec CD36 et CD47 et inhibent MMP2/9, des répétitions de type II semblables à l'EGF, et 15 répétitions d'homologie de calponine avec un motif RGD dans la dernière répétition conférant une affinité pour les intégrines αvβ3 et αIIbβ3. La protéine se termine par un domaine globulaire C-terminal de type lectine qui lie les protéoglycanes et stabilise les oligomères par des liaisons disulfures intercaténaires au niveau de Cys252 et Cys256. La TSP-1 inhibe puissamment Angiogenesis en regroupant CD47, perturbant ainsi la signalisation VEGF-R2 et de l'oxyde nitrique (NO) via le recrutement de la phosphatase SHP-2 et le blocage de la S-nitrosylation de l'eNOS. La TSP-1 active également le TGF-β1 latent par le dépliement dépendant du cisaillement du peptide associé à la latence, médié par l'intégrine αvβ3/β8, conduisant à la phosphorylation de Smad2/3 et à la fibrose. Elle induit l'anoïkis et l'apoptose médiée par CD36 dans les cellules endothéliales et musculaires lisses via les cascades de caspase-8/3 et l'inhibition de Fyn/FAK, tout en favorisant paradoxalement la transmigration leucocytaire et la phagocytose par l'engouffrement médié par la calréticuline/LRP1/CD91 des corps apoptotiques ou des agents pathogènes. La carence en TSP-1 exacerbe la tumorigénèse en permettant l'Angiogenesis pathologique et l'évasion immunitaire dans des modèles de cancer du sein et de la prostate, tandis que son fragment 3TSR possède une forte activité anti-angiogénique lorsqu'il est libéré par le clivage d'ADAMTS1.

Spécificité

Thrombospondin 1 Antibody [N18C17] détecte les niveaux endogènes de la protéine Thrombospondin 1 totale.

Contexte

La thrombospondine-1 (TSP-1 ou THBS1) est une glycoprotéine matricellulaire homotrimérique sécrétée par les plaquettes, les cellules endothéliales et les fibroblastes, et s'intègre dans la matrice extracellulaire pour réguler le remodelage tissulaire via un large éventail d'interactions ligandiques. La TSP-1 est constituée d'un domaine globulaire N-terminal TSPN qui forme un sandwich β de 13 brins antiparallèles avec un segment β4′ irrégulier distinctif et une liaison disulfure au niveau de la Cys248, permettant la liaison à l'héparine, à l'agrécane et à l'intégrine αvβ3. Cela est suivi d'un domaine C du facteur de von Willebrand, de trois répétitions de type I (TSRs) caractérisées par des échelles de tryptophane/arginine empilées et des motifs WXXWCSXG conservés qui médient l'engagement avec CD36 et CD47 et inhibent MMP2/9, des répétitions de type II semblables à l'EGF, et 15 répétitions d'homologie de calponine avec un motif RGD dans la dernière répétition conférant une affinité pour les intégrines αvβ3 et αIIbβ3. La protéine se termine par un domaine globulaire C-terminal de type lectine qui lie les protéoglycanes et stabilise les oligomères par des liaisons disulfures intercaténaires au niveau de Cys252 et Cys256. La TSP-1 inhibe puissamment Angiogenesis en regroupant CD47, perturbant ainsi la signalisation VEGF-R2 et de l'oxyde nitrique (NO) via le recrutement de la phosphatase SHP-2 et le blocage de la S-nitrosylation de l'eNOS. La TSP-1 active également le TGF-β1 latent par le dépliement dépendant du cisaillement du peptide associé à la latence, médié par l'intégrine αvβ3/β8, conduisant à la phosphorylation de Smad2/3 et à la fibrose. Elle induit l'anoïkis et l'apoptose médiée par CD36 dans les cellules endothéliales et musculaires lisses via les cascades de caspase-8/3 et l'inhibition de Fyn/FAK, tout en favorisant paradoxalement la transmigration leucocytaire et la phagocytose par l'engouffrement médié par la calréticuline/LRP1/CD91 des corps apoptotiques ou des agents pathogènes. La carence en TSP-1 exacerbe la tumorigénèse en permettant l'Angiogenesis pathologique et l'évasion immunitaire dans des modèles de cancer du sein et de la prostate, tandis que son fragment 3TSR possède une forte activité anti-angiogénique lorsqu'il est libéré par le clivage d'ADAMTS1.

Informations dutilisation

Application

WB, IP

Dilution

WB	IP
1:1000	1:100

Réactivité

Human, Mouse, Rat

Source

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

170 kDa

Tampon de stockage

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

Stockage
(À partir de la date de réception)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

Méthodes expérimentales
WB	Experimental Protocol: Sample preparation 1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature. 2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant; 5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration; 6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice. Electrophoretic separation 1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 5%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations 2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.) Transfer membrane 1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter; 2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer; 3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip"; 4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min. ( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.) Block 1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes; 2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature; 3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time. Antibody incubation 1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight; 2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time; 3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour; 4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time. Antibody staining 1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly; 2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Méthodes expérimentales

WB

Experimental Protocol:

Sample preparation

1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature.

2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant;

5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration;

6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice.

Electrophoretic separation

1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 5%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations

2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.)

Transfer membrane

1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter;

2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer;

3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip";

4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications

Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min.

( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.)

Block

1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes;

2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature;

3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time.

Antibody incubation

1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight;

2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time;

3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour;

4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time.

Antibody staining

1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly;

2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Références

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16407063/
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29137447/

Données dapplication

WB

Validé par Selleck

Lane 1: ACHN, Lane 2: LN18, Lane 3: MEF