Sunitinib (SU11248) Malate

Le Sunitinib inhibe également puissamment Kit et FLT-3. [1] Le Sunitinib est un puissant inhibiteur compétitif de l'ATP de VEGFR2 (Flk1) et PDGFRβ avec des K_i de 9 nM et 8 nM, respectivement, affichant une sélectivité >10 fois supérieure pour VEGFR2 et PDGFR que pour FGFR-1, EGFR, Cdk2, Met, IGFR-1, Abl et src. Dans les cellules NIH-3T3 privées de sérum exprimant VEGFR2 ou PDGFRβ, le Sunitinib inhibe la phosphorylation de VEGFR2 dépendante du VEGF et la phosphorylation de PDGFRβ dépendante du PDGF avec une IC50 de 10 nM et 10 nM, respectivement. Le Sunitinib inhibe la prolifération induite par le VEGF des HUVEC privées de sérum avec une IC50 de 40 nM, et inhibe la prolifération induite par le PDGF des cellules NIH-3T3 surexprimant PDGFRβ ou PDGFRα avec une IC50 de 39 nM et 69 nM, respectivement. [2] Le Sunitinib inhibe la phosphorylation des FLT3 de type sauvage, FLT3-ITD et FLT3-Asp835 avec des IC50 de 250 nM, 50 nM et 30 nM, respectivement. Le Sunitinib inhibe la prolifération des cellules MV4;11 et OC1-AML5 avec des IC50 de 8 nM et 14 nM, respectivement, et induit l'apoptose de manière dose-dépendante. [3]

Conformément à l'inhibition substantielle et sélective de la phosphorylation et de la signalisation de VEGFR2 ou PDGFR in vivo, le Sunitinib (20-80 mg/kg/jour) présente une activité antitumorale large et puissante dose-dépendante contre une variété de modèles de xénogreffes tumorales, y compris HT-29, A431, Colo205, H-460, SF763T, C6, A375 ou MDA-MB-435. L'administration de Sunitinib à 80 mg/kg/jour pendant 21 jours entraîne une régression tumorale complète chez six des huit souris, sans repousse tumorale pendant une période d'observation de 110 jours après la fin du traitement. Une deuxième série de traitement avec le Sunitinib reste efficace contre les tumeurs qui n'ont pas complètement régressé pendant la première série de traitement. Le traitement au Sunitinib entraîne une diminution significative de la MVD tumorale, avec une réduction d'environ 40 % dans les tumeurs de gliome SF763T. Le traitement au SU11248 entraîne une inhibition complète de la croissance tumorale supplémentaire des xénogreffes PC-3M exprimant la luciférase, malgré l'absence de réduction de la taille de la tumeur. [2] Le traitement au Sunitinib (20 mg/kg/jour) supprime de manière spectaculaire la croissance des xénogreffes sous-cutanées MV4;11 (FLT3-ITD) et prolonge la survie dans le modèle de greffe de moelle osseuse FLT3-ITD. [3]

• Tests biochimiques de tyrosine kinase

  Les valeurs IC50 du Sunitinib contre VEGFR2 (Flk-1) et PDGFRβ sont déterminées à l'aide de protéines de fusion glutathion S-transférase contenant le domaine cytoplasmique complet de la RTK. Les tests biochimiques de tyrosine kinase pour quantifier l'activité de trans-phosphorylation de VEGFR2 (Flk-1) et PDGFRβ sont effectués dans des plaques de microtitration à 96 puits pré-enduites (20 μg/puits dans du PBS ; incubées pendant une nuit à 4 °C) avec le substrat peptidique poly-Glu,Tyr (4:1). Les sites de liaison protéiques en excès sont bloqués par l'addition de 1 à 5 % (p/v) de BSA dans du PBS. Les protéines de fusion GST purifiées sont produites dans des cellules d'insectes infectées par le baculovirus. Le GST-VEGFR2 et le GST-PDGFRβ sont ensuite ajoutés aux puits de microtitration dans un tampon de dilution de kinase à 2 × concentration, composé de 100 mM HEPES, 50 mM NaCl, 40 μM NaVO₄ et 0,02 % (p/v) de BSA. La concentration enzymatique finale pour le GST-VEGFR2 ou le GST-PDGFRβ est de 50 ng/mL. Vingt-cinq μL de Sunitinib dilué sont ensuite ajoutés à chaque puits de réaction pour produire une gamme de concentrations d'inhibiteur appropriées pour chaque enzyme. La réaction de kinase est initiée par l'addition de différentes concentrations d'ATP dans une solution de MnCl₂, de sorte que les concentrations finales d'ATP couvrent le Km de l'enzyme, et la concentration finale de MnCl₂ est de 10 mM. Les plaques sont incubées pendant 5 à 15 minutes à température ambiante avant d'arrêter la réaction par l'ajout d'EDTA. Les plaques sont ensuite lavées trois fois avec du TBST. Des antisérums polyclonaux de lapin anti-phosphotyrosine sont ajoutés aux puits à une dilution de 1:10 000 dans du TBST contenant 0,5 % (p/v) de BSA, 0,025 % (p/v) de lait écrémé en poudre et 100 μM NaVO₄ et incubés pendant 1 heure à 37 °C. Les plaques sont ensuite lavées trois fois avec du TBST, suivies de l'ajout d'antisérums de chèvre anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort (dilution 1:10 000 dans du TBST). Les plaques sont incubées pendant 1 heure à 37 °C, puis lavées trois fois avec du TBST. La quantité de phosphotyrosine dans chaque puits est quantifiée après l'ajout de 2,2′-azino-di-[3-éthylbenzthiazoline sulfonate] comme substrat.

• Lignées cellulaires

  RS4;11, MV4;11, and OC1-AML5

• Concentrations

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Temps dincubation

  24 and 48 hours

• Méthode

  Cells are starved overnight in medium containing 0.1% FBS prior to addition of Sunitinib and FL (50 ng/mL; FLT3-WT cells only). Proliferation is measured after 48 hours of culture using the Alamar Blue assay or trypan blue cell viability assays. Apoptosis is measured 24 hours after Sunitinib addition by Western blotting to detect cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) or levels of caspase-3.

• Modèles animaux

  Female nu/nu mice implanted s.c. with HT-29, A431, Colo205, H-460, SF763T, C6, A375, or MDA-MB-435, and male nu/nu mice bearing luciferase-expressing PC-3M tumors

• Dosages

  ~80 mg/kg

• Administration

  Orally once daily