Fiche technique

Description biologique

Spécificité	SEP15 Antibody [A2N16] reconnaît les niveaux endogènes de la protéine SEP15 totale.
Contexte	Sep15 (sélénoprotéine de 15 kDa) est une protéine localisée dans le réticulum endoplasmique (RE) avec des propriétés de type thiorédoxine, impliquée dans le contrôle qualité des Glycoprotein. Elle fonctionne en interagissant avec l'UDP-glucose:Glycoprotein glucosyltransférase, un acteur clé dans le repliement des Glycoprotein. Bien que le rôle biologique précis de Sep15 reste incertain, son expression est connue pour être influencée à la fois par le sélénium alimentaire et la réponse aux protéines non repliées. Sep15 est régulée à la hausse dans des conditions de stress adaptatif du RE, suggérant qu'elle joue un rôle dans les réponses au stress cellulaire. Le gène Sep15 humain est situé sur le chromosome 1p31 — une région génomique fréquemment délétée ou mutée dans divers cancers. De plus, deux sites polymorphes dans le gène Sep15 ont un impact sur la façon dont son expression répond à l'apport en sélénium. Notamment, l'expression de Sep15 est réduite dans plusieurs types de cancer. Des niveaux inférieurs ont été observés dans des lignées cellulaires de cancer de la prostate et des tissus de carcinome hépatocellulaire, ainsi que dans des tumeurs malignes du poumon, du sein, de la prostate et du foie par rapport à leurs homologues non cancéreux. Ces résultats suggèrent que Sep15 pourrait fonctionner comme un suppresseur de tumeur, potentiellement en régulant le repliement et/ou la sécrétion des Glycoproteins pertinents pour la progression du cancer.

Spécificité

SEP15 Antibody [A2N16] reconnaît les niveaux endogènes de la protéine SEP15 totale.

Contexte

Sep15 (sélénoprotéine de 15 kDa) est une protéine localisée dans le réticulum endoplasmique (RE) avec des propriétés de type thiorédoxine, impliquée dans le contrôle qualité des Glycoprotein. Elle fonctionne en interagissant avec l'UDP-glucose:Glycoprotein glucosyltransférase, un acteur clé dans le repliement des Glycoprotein. Bien que le rôle biologique précis de Sep15 reste incertain, son expression est connue pour être influencée à la fois par le sélénium alimentaire et la réponse aux protéines non repliées. Sep15 est régulée à la hausse dans des conditions de stress adaptatif du RE, suggérant qu'elle joue un rôle dans les réponses au stress cellulaire. Le gène Sep15 humain est situé sur le chromosome 1p31 — une région génomique fréquemment délétée ou mutée dans divers cancers. De plus, deux sites polymorphes dans le gène Sep15 ont un impact sur la façon dont son expression répond à l'apport en sélénium. Notamment, l'expression de Sep15 est réduite dans plusieurs types de cancer. Des niveaux inférieurs ont été observés dans des lignées cellulaires de cancer de la prostate et des tissus de carcinome hépatocellulaire, ainsi que dans des tumeurs malignes du poumon, du sein, de la prostate et du foie par rapport à leurs homologues non cancéreux. Ces résultats suggèrent que Sep15 pourrait fonctionner comme un suppresseur de tumeur, potentiellement en régulant le repliement et/ou la sécrétion des Glycoproteins pertinents pour la progression du cancer.

Informations dutilisation

Application

WB

Dilution

WB

1:1000 - 1:10000

Réactivité

Rat, Human

Source

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

18 kDa

Tampon de stockage

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

Stockage
(À partir de la date de réception)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

Méthodes expérimentales
WB	Experimental Protocol: Sample preparation 1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature. 2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant; 5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration; 6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice. Electrophoretic separation 1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations 2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.) Transfer membrane 1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter; 2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer; 3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip"; 4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.22 µm PVDF membrane is recommended )） Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 60 min. ( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.) Block 1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes; 2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature; 3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time. Antibody incubation 1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight; 2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time; 3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour; 4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time. Antibody staining 1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly; 2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Méthodes expérimentales

WB

Experimental Protocol:

Sample preparation

1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature.

2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant;

5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration;

6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice.

Electrophoretic separation

1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations

2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.)

Transfer membrane

1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter;

2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer;

3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip";

4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.22 µm PVDF membrane is recommended )） Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications

Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 60 min.

( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.)

Block

1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes;

2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature;

3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time.

Antibody incubation

1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight;

2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time;

3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour;

4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time.

Antibody staining

1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly;

2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Références

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21768092/

Données dapplication

WB

Validé par Selleck

Lane 1: Rat liver, Lane 2: Fetal liver, Lane 3: LnCaP