Fiche technique

Description biologique

Spécificité	Phospho-Hsp27 (Ser82) Antibody [M1P19] détecte les niveaux endogènes de la protéine Phospho-HSP27 (Ser82) totale uniquement lorsqu'elle est phosphorylée en Ser82.
Contexte	La protéine de choc thermique 27 (HSP27) est un membre de la famille des petites protéines de choc thermique (sHSP) (12 à 43 kDa) et présente un large éventail de fonctions cellulaires. Elle agit comme un chaperon moléculaire, un antioxydant, un régulateur de l'apoptose et un médiateur du remodelage du cytosquelette d'actine. Comme d'autres petites HSP, HSP27 contient un domaine α-cristalline conservé situé dans sa région C-terminale. Sous stress oxydatif, HSP27 protège les cellules en abaissant les niveaux intracellulaires d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), ce qui est réalisé en améliorant la production de glutathion et en réduisant la disponibilité du fer libre. Elle présente également une forte activité anti-apoptotique, influençant les voies apoptotiques dépendantes et indépendantes des mitochondries. Par exemple, HSP27 se lie à DAXX pendant l'apoptose médiée par Fas–FasL, empêchant DAXX de s'associer à ASK1. De plus, elle interagit avec Bax et le cytochrome c, supprimant ainsi l'apoptose mitochondriale et bloquant la mort cellulaire dépendante des caspases. HSP27 est exprimée à des niveaux basaux dans la plupart des cellules et tissus, où elle existe généralement sous forme de grands complexes oligomériques. Lors d'une exposition au stress, son expression augmente significativement, améliorant la résistance cellulaire aux conditions délétères. La protéine est sujette à une phosphorylation induite par le stress aux Ser15, Ser78 et Ser82 chez l'homme (Ser15 et Ser86 chez les rongeurs), médiée par la kinase MAPKAP 2/3 en aval de la voie de signalisation p38 MAPK. La phosphorylation influence non seulement son état oligomérique mais régule également ses interactions avec les protéines partenaires. Dans les neutrophiles, HSP27 forme un complexe avec AKT et la kinase MAPKAP 2, ce qui supprime l'apoptose constitutive et favorise une réponse inflammatoire. La phosphorylation induite par le stress de HSP27 perturbe ce complexe, entraînant la dissociation d'AKT et la restauration de l'apoptose des neutrophiles. Notamment, les effets de HSP27 phosphorylée sont fortement dépendants du contexte, variant selon le type de cellule et l'environnement de signalisation.

Spécificité

Phospho-Hsp27 (Ser82) Antibody [M1P19] détecte les niveaux endogènes de la protéine Phospho-HSP27 (Ser82) totale uniquement lorsqu'elle est phosphorylée en Ser82.

Contexte

La protéine de choc thermique 27 (HSP27) est un membre de la famille des petites protéines de choc thermique (sHSP) (12 à 43 kDa) et présente un large éventail de fonctions cellulaires. Elle agit comme un chaperon moléculaire, un antioxydant, un régulateur de l'apoptose et un médiateur du remodelage du cytosquelette d'actine. Comme d'autres petites HSP, HSP27 contient un domaine α-cristalline conservé situé dans sa région C-terminale. Sous stress oxydatif, HSP27 protège les cellules en abaissant les niveaux intracellulaires d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), ce qui est réalisé en améliorant la production de glutathion et en réduisant la disponibilité du fer libre. Elle présente également une forte activité anti-apoptotique, influençant les voies apoptotiques dépendantes et indépendantes des mitochondries. Par exemple, HSP27 se lie à DAXX pendant l'apoptose médiée par Fas–FasL, empêchant DAXX de s'associer à ASK1. De plus, elle interagit avec Bax et le cytochrome c, supprimant ainsi l'apoptose mitochondriale et bloquant la mort cellulaire dépendante des caspases. HSP27 est exprimée à des niveaux basaux dans la plupart des cellules et tissus, où elle existe généralement sous forme de grands complexes oligomériques. Lors d'une exposition au stress, son expression augmente significativement, améliorant la résistance cellulaire aux conditions délétères. La protéine est sujette à une phosphorylation induite par le stress aux Ser15, Ser78 et Ser82 chez l'homme (Ser15 et Ser86 chez les rongeurs), médiée par la kinase MAPKAP 2/3 en aval de la voie de signalisation p38 MAPK. La phosphorylation influence non seulement son état oligomérique mais régule également ses interactions avec les protéines partenaires. Dans les neutrophiles, HSP27 forme un complexe avec AKT et la kinase MAPKAP 2, ce qui supprime l'apoptose constitutive et favorise une réponse inflammatoire. La phosphorylation induite par le stress de HSP27 perturbe ce complexe, entraînant la dissociation d'AKT et la restauration de l'apoptose des neutrophiles. Notamment, les effets de HSP27 phosphorylée sont fortement dépendants du contexte, variant selon le type de cellule et l'environnement de signalisation.

Informations dutilisation

Application

WB, IP

Dilution

WB	IP
1:1000 - 1:2000	1:75

Réactivité

Mouse, Rat, Human

Source

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

23 kDa

Tampon de stockage

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

Stockage
(À partir de la date de réception)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

Méthodes expérimentales
WB	Experimental Protocol: Sample preparation 1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature. 2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant; 5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration; 6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice. Electrophoretic separation 1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations 2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.) Transfer membrane 1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter; 2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer; 3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip"; 4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 60 min. ( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.) Block 1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes; 2. Incubate the film in the blocking solution ( recommending 5% BSA solution) for 1 hour at room temperature; 3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time. Antibody incubation 1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight; 2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time; 3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour; 4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time. Antibody staining 1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly; 2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Méthodes expérimentales

WB

Experimental Protocol:

Sample preparation

1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature.

2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant;

5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration;

6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice.

Electrophoretic separation

1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations

2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.)

Transfer membrane

1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter;

2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer;

3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip";

4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications

Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 60 min.

( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.)

Block

1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes;

2. Incubate the film in the blocking solution ( recommending 5% BSA solution) for 1 hour at room temperature;

3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time.

Antibody incubation

1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight;

2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time;

3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour;

4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time.

Antibody staining

1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly;

2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Références

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22564335/

Données dapplication

WB

Validé par Selleck

Lane 1: HeLa (with 44°C heat shock), Lane 2: HeLa, Lane 3: Mouse heart, Lane 4: Rat heart