BIBF 1120 (Nintedanib)

BIBF1120 inhibe l'activité kinase du PDGFR des types PDGFR alpha et PDGFR bêta avec des valeurs d'IC50 de 59 nM et 65 nM, respectivement. De plus, BIBF1120 supprime les sous-types de FGFR avec des IC50 de 60 nM, 37 nM et 108 nM pour FGFR1, FGFR2 et FGFR3, respectivement. BIBF1120 se lie au site de liaison de l'ATP dans la fente entre les lobes amino et carboxy-terminaux du domaine kinase. L'échafaudage d'indolinone forme deux liaisons hydrogène avec l'azote de l'ossature de la Cys⁹¹⁹ et l'oxygène carbonyle de l'ossature de la Glu⁹¹⁷ dans la région charnière. BIBF 1120 inhibe la prolifération des BRP stimulés par le PDGF-BB avec une EC50 de 79 nM dans des essais cellulaires. BIBF1120, à des concentrations aussi faibles que 100 nM, bloque l'activation de MAPK après stimulation avec 5% de sérum plus PDGF-BB. Dans des cultures de cellules musculaires lisses vasculaires humaines (HUASMC), BIBF1120 prévient la prolifération stimulée par le PDGF-BB avec une EC50 de 69 nM. [1]

Dans tous les modèles tumoraux testés jusqu'à présent, y compris les xénogreffes tumorales humaines cultivées chez des souris nues et un modèle tumoral syngénique chez le rat, le BIBF1120 est très actif à des doses bien tolérées (25-100 mg/kg par jour p.o.). Cela est évident dans l'imagerie par résonance magnétique de la perfusion tumorale après 3 jours, réduisant la densité et l'intégrité des vaisseaux après 5 jours, et une inhibition profonde de la croissance. [1]

• Dosage de la Kinase VEGFR2

  Le domaine de la tyrosine kinase cytoplasmique de VEGFR2 (résidus 797-1355 selon la séquence déposée dans la banque de données SWISS-PROT P35968) est cloné dans pFastBac fusionné au GST et extrait. L'activité enzymatique est testée en présence ou en l'absence de dilutions en série de BIBF1120 réalisées dans 25% de DMSO. Chaque plaque de microtitration contient des contrôles internes tels que le blanc, la réaction maximale et le composé de référence historique. Toutes les incubations sont réalisées à température ambiante sur un agitateur rotatif. 10 μL de chaque dilution de BIBF1120 sont ajoutés à 10 μL de kinase diluée (0,8 μg/mL de VEGFR2, 10 mM de Tris pH 7,5, 2 mM d'EDTA et 2 mg/mL de BSA) et pré-incubés pendant 1 heure. La réaction est initiée par l'addition de 30 μL de mélange de substrat contenant 62,4 mM de Tris pH 7,5, 2,7 mM de DTT, 5,3 mM de MnCl₂, 13,3 mM d'acétate de Mg, 0,42 mM d'ATP, 0,83 mg/mL de Poly-Glu-Tyr(4:1) et 1,7 μg/mL de Poly-Glu-Tyr(4:1)-biotine et incubée pendant 1 heure. La réaction est arrêtée par l'addition de 50 μL de 250 mM d'EDTA, 20 mM de HEPES, pH 7,4. 90 μL du mélange réactionnel sont transférés dans une plaque de streptavidine et incubés pendant 1 à 2 heures. Après trois lavages avec du PBS, l'anticorps marqué à l'EU, PY20, est ajouté (dilution recommandée 1:2000 de 0,5 mg/mL d'anticorps marqué dans le tampon d'essai DELFIA). L'excès d'anticorps de détection est éliminé par trois lavages avec le tampon de lavage DELFIA. Ensuite, 10 minutes avant la mesure sur le lecteur multilabel, chaque puits est incubé avec 100 μL de solution d'amélioration DELFIA.

• Lignées cellulaires

  HUVEC, HUASMC, and BRP cell lines

• Concentrations

  50 nM

• Temps dincubation

  2 hours

• Méthode

  The cell lines HUVEC, HUASMC, and BRP are used for the assay. BIBF1120 is added to the cultures two hours before the addition of ligands. Cell lysates are generated. Western blotting is done using standard SDS-PAGE methods, loading 50 to 75 μg of protein per lane. Detection is facilitated by enhanced chemiluminescence. Total and phosphorylated mitogen-activated protein kinase (MAPK) is analyzed using monoclonal antibodies M3807 and M8159. Total Akt is detected using the corresponding polyclonal antibody and phosphorylated Akt (Ser473) is analyzed by using its monoclonal antibody. Monoclonal antibody is also used to detect cleaved caspase-3 while KDR (VEGFR2) protein is detected using a corresponding antibody.

• Modèles animaux

  FaDu, Caki-1, SKOV-3, H460, HT-29, or PAC-120 xenografts in Athymic NMRI-nu/nu female mice

• Dosages

  100 mg/kg

• Administration

  p.o.