GW843682X

GW 843682X est un inhibiteur submicromolaire de la prolifération de la plupart des cellules tumorales en culture, à l'exception notable de PC-3, une lignée cellulaire de carcinome prostatique. GW 843682X est également sélectif pour les cellules tumorales par rapport aux fibroblastes diploïdes normaux (HDF), avec une différence de puissance >10 fois. GW 843682X est équipotent (~200 nmol/L) contre MES-SA/DX5 et la lignée parentale MES-SA, suggérant que le composé n'est pas efficacement éliminé par la pompe d'efflux de la P-glycoprotéine dans la cellule. GW 843682X inhibe la phosphorylation de la Ser15-p53 par PLK1 de manière dose-dépendante dans les cellules HeLa exprimant la protéine chimérique p53-PLK1 inductible par la tétracycline. GW 843682X améliore la croissance cellulaire HDF de 30 % à 3,3 µM et est capable d'améliorer la croissance H460 à la concentration la plus basse de 0,37 µM. GW 843682X entraîne un fort arrêt G2-M à 3 µM et un très faible arrêt G2-M est observé à 1 µM dans les cellules HDF. GW 843682X (3 µM) montre un arrêt G2-M réduit, mais il y a une augmentation du contenu d'ADN sub-2N dans les cellules H460. GW 843682X (0,5 µM) entraîne des cellules de taille plus grande que les cellules H460 non traitées et possédant plusieurs noyaux. [1] GW 843682X inhibe PLK1, PLK2, PLK3 et PLK4 avec des valeurs Ki de 4,8 nM, 3,8 nM, 8 nM et 0,163 µM, respectivement. [2] GW 843682X (1 µM) interfère avec la localisation de MyoGEF endogène au niveau du fuseau central dans les cellules HeLa. GW 843682X (1 µM) perturbe la localisation de GFP-MyoGEF-wt (GFP-WT), GFP-MyoGEF-T574A (GFP-T574A) et GFP-MyoGEF-T574E (GFP-T574E) au niveau du fuseau central dans les cellules HeLa. [3] GW-843682X provoque un assemblage prématuré identique de la zone médiane et un recrutement de protéines, suggérant que l'effet du médicament est spécifique à l'inhibition de PLK1. GW 843682X (200 nM) provoque un regroupement des microtubules et un recrutement de la spindline centrale et de PRC1 à l'équateur dans les cellules HeLa. [4]

• Essais Kinase In Vitro

  PLK1 et PLK3 sont ajoutés à des plaques d'essai blanches de 384 puits à des concentrations connues variables dans 100% de DMSO. Le DMSO (1–5% final) et l'EDTA (65 mM) sont utilisés comme contrôles. Le mélange réactionnel contient les composants suivants à 22°C : 25 mM HEPES (pH 7,2) ; 15 mM MgCl₂ ; 1 μM ATP ; 0,05 μCi/puits [γ-³³P]ATP (10 Ci/mmol) ; 1 μM peptide substrat ; 0,15 mg/mL d'albumine de sérum bovin ; 1 mM DTT ; et 2 nM de domaine kinase PLK1 ou 5 nM de PLK3 pleine longueur. Le mélange réactionnel (10 ou 20 μL) est rapidement ajouté à chaque puits immédiatement après l'ajout de l'enzyme via des manipulateurs de liquides automatisés et incubé pendant 1 à 1,5 h à 22°C. Les réactions enzymatiques de 20 μL sont arrêtées avec 50 μL de mélange d'arrêt [50 mM EDTA, 4,0 mg/mL de billes SPA de streptavidine dans Dulbecco

• Lignées cellulaires

  H460 and HDF cells

• Concentrations

  3 μM

• Temps dincubation

  72 hours

• Méthode

  H460 cells are plated at a density of 2×10³ per well, HDF cells are plated at 5×10³ per well, and the drug-resistant cell line MES-SA/DX5 and its sensitive parent line MES-SA are plated at 7×10³ and 6×10³ per well, respectively, in a 96-well plate. These densities allow vehicle controls to grow logarithmically during the course of the 3-day assay. All cells are exposed to 3-fold dilutions of GW 843682X (30–0.00152 μM) in low-glucose DMEM containing 5% FBS, and 0.3% (v/v) DMSO (HDF cells); RPMI 1640 containing 5% FBS, and 0.3% (v/v) DMSO (H460); or McCoy's 5A containing 5% FBS, and 0.3% (v/v) DMSO (MES-SA and MES-SA/DX5).