EPZ004777

EPZ004777 est dilué en série 3 fois dans du DMSO pour un total de dix concentrations, en commençant à 1 mM. Une aliquote de 1 μL de chaque dilution d'inhibiteur est déposée dans une plaque de microtitration à 384 puits. Le contrôle d'inhibition à 100 % consistait en une concentration finale de 2,5 mM de l'inhibiteur de produit S-adénosyl-L-homocystéine (SAH). Ce composé est incubé pendant 30 min avec 40 ml par puits de 0,25 nM de DOT1L(1-416) dans un tampon d'essai (20 mM TRIS [pH 8.0] 10 mM NaCl, 0,002 % Tween 20, 0,005 % gélatine de peau bovine, 100 mM KCl et 0,5 mM DTT). 10 ml par puits de mélange de substrat comprenant un tampon d'essai avec 200 nM de ³H-SAM (American Radiolabeled Chemicals : 80 Ci/mmol), 600 nM de SAM non marqué et 20 nM de nucléosomes sont ajoutés pour initier la réaction (les deux substrats sont présents dans le mélange réactionnel final à leurs valeurs KM respectives). Les réactions sont incubées pendant 120 min et éteintes avec 10 ml par puits de 800 mM de SAM. L'incorporation de radioactivité dans le substrat de nucléosome est mesurée dans une flashplate. Les valeurs d'IC50 pour les enzymes du panneau Histone Methyltransferase sont déterminées dans des conditions d'essai équilibrées similaires avec le SAM et le substrat protéique/peptidique présents à des concentrations égales à leurs valeurs KM respectives.

Human leukemia cell lines MV4-11, THP-1, RS4;11, Kasumi-1, HL-60, REH, and Jurkat. SEM, KOPN-8, 697, U937 and MOLM-13 cells.

~50 μM

14-18 days

For assessment of cell proliferation and viability in human cell lines, exponentially growing cells are plated, in triplicate, in 96-well plates in a final volume of 150 ml. Cells are incubated in the presence of 3 μM (proliferation curve), or increasing concentrations (IC50 determination) of EPZ004777 up to 50 μM. Viable cell number is determined every 3–4 days for up to 18 days using the Guava Viacount assay and analyzed on a Guava EasyCyte Plus instrument according to the manufacturer’s protocol. On days of cell counts, growth media and this compound are replaced and cells split back to a density of 5×10⁴ cells/well. Total cell number is expressed as split-adjusted viable cells per well. For each cell line, IC50 values are determined from concentration-dependence curves at each time point using Graphpad Prism software. Experiments to determine IC50 values continues until IC50 values stabilized (day 18 for THP-1 cells, day 14 for all other cell lines). For assessment of the effect of this compound treatment on transformed murine hematopoietic progenitors, cells from two independent transductions for each virus are plated in 24-well plates at a density of 0.5–1×10⁵ cell/well in 1 ml media in 24-well plates and exposed to increasing concentrations of this chemical up to 30 mM. Cells are counted and replated at equal cell numbers in fresh media with fresh compound every 3–4 days. For MTT assays, cells from serial replatings are harvested on day 10 and plated, in triplicate at 2×10⁴ cells/well in 100 ml media with the appropriate concentration of this compound. Cells are incubated for 2.5 days, the exposed to 10 ml MTT reagent for 3 hr, and lysed over night in 100 ml MTT- solubilization buffer (both from Cell Proliferation Kit I [MTT]).

A mouse xenograft MV4-11 model of MLL.

Mini-pumps containing 100 and 150 mg/mL EPZ004777 solutions

Osmotic pump