Cyclosporin A

Cyclosporin A se lie à la cyclophiline (immunophiline) dans les lymphocytes T[1], forme un complexe Cyclophiline-ce composé qui se lie et inhibe ensuite Calcineurin. [2] Ce composé chimique inhibe Calcineurin avec une IC50 de 7 nM[3], puis bloque la translocation nucléaire de NF-AT. [4] Il affecte également les mitochondries en empêchant l'ouverture du MTP (pore de transition de perméabilité mitochondriale) avec une IC50 de 39 nM. [5]

Cyclosporin A est un agent immunosuppresseur efficace après administration parentérale ou orale chez la souris, le rat et le cobaye. [6], il est utilisé cliniquement en transplantation d'organes pour prévenir le rejet. [7]

• phosphatase Assay

  La Calcineurin et la calmoduline purifiées de cerveau bovin sont achetées. Les mélanges réactionnels avec l'enzyme purifiée contiennent 100 nM de Calcineurin, 100 nM de calmoduline et 5 μM de phosphopeptide marqué au ³²P, dans 60 μl (volume total) de tampon d'essai contenant 20 mM de Tris (pH 8), 100 mM de NaCl, 6 mM de MgCl₂, 0,5 mM de dithiothréitol, 0,1 mg d'albumine de sérum bovin par ml, et soit 0,1 mM de CaCl₂ soit 5 mM d'EGTA. Les mélanges réactionnels avec les lysats cellulaires contiennent 20 μl de lysat non dilué, 5 μM de phosphopeptide marqué au ³²P et 40 μl de tampon d'essai. Le cas échéant, les mélanges réactionnels contiennent 50 μM de peptide 412 ou 413 et/ou 500 nM d'acide okadaïque, un inhibiteur spécifique des phosphatases 1 et 2A; 500 nM d'acide okadaïque est suffisant pour l'inhibition des phosphatases indépendantes du Ca²⁺, tandis que des concentrations plus élevées inhibent partiellement également l'activité dépendante du Ca²⁺. Après 15 min à 30°C, les réactions sont terminées par l'ajout de 0,5 ml de tampon phosphate de potassium 100 mM (pH 7,0) contenant 5% d'acide trichloroacétique. Le phosphate inorganique libre est isolé par chromatographie d'échange de cations Dowex et quantifié par comptage par scintillation comme décrit.

• Lignées cellulaires

  Jurkat cells (clone J77)

• Concentrations

  ~100 nM

• Temps dincubation

  1 hr

• Méthode

  Immunosuppressive agents are dissolved in ethanol at concentrations 1000-fold more than the concentration desired for cell treatments. Cells (10⁶) are suspended in 1 ml of complete medium in microcentrifuge tubes; 1 μl of ethanol or of the ethanolic solution of Cyclosporin A is added, and the cells are incubated at 37°C for 1 hr. Cells are washed twice with 1 ml of PBS on ice and lysed in 50μl of hypotonic buffer containing 50 mM Tris (pH 7.5); 0.1 mM EGTA; 1 mM EDTA; 0.5 mM dithiothreitol; and 50 μg of phenylmethylsulfonyl fluoride, 50 μg of soybean trypsin inhibitor, 5 μg of leupeptin, and 5 μg of aprotinin per ml. Lysates are subjected to three cycles of freezing in liquid nitrogen followed by thawing at 30°C and then are centrifuged at 4°C for 10 min at 12,000×g.

• Modèles animaux

  Rat

• Dosages

  45 mg/kg

• Administration

  orally