Crizotinib hydrochloride

Le PF-2341066 présente une puissance similaire contre la phosphorylation de c-Met dans les cellules épithéliales de souris mIMCD3 ou de chien MDCK avec des IC50 de 5 nM et 20 nM, respectivement. Le PF-2341066 montre une activité améliorée ou similaire contre les cellules NIH3T3 modifiées pour exprimer les mutants V1092I ou H1094R du site de liaison de l'ATP de c-Met ou le mutant M1250T de la boucle P avec des IC50 de 19 nM, 2 nM et 15 nM, respectivement, par rapport aux cellules NIH3T3 exprimant le récepteur de type sauvage avec un IC50 de 13 nM. En revanche, un décalage marqué de la puissance du PF-2341066 est observé contre les cellules modifiées pour exprimer les mutants Y1230C et Y1235D de la boucle d'activation de c-Met avec des IC50 de 127 nM et 92 nM, respectivement, par rapport au récepteur de type sauvage. Le PF-2341066 prévient également puissamment la phosphorylation de c-Met dans les cellules NCI-H69 et HOP92, avec des IC50 de 13 nM et 16 nM, respectivement, qui expriment les variants endogènes R988C et T1010I de c-Met, respectivement. Le PF-2341066 est >1 000 fois sélectif pour les RTK VEGFR2 et PDGFRβ, >250 fois sélectif pour IRK et Lck, et ~40 à 60 fois sélectif pour Tie2, TrkA et TrkB, tous comparés à c-Met. Le PF-2341066 est 20 à 30 fois sélectif pour les RTK RON et Axl. En revanche, le PF-2341066 montre un IC50 quasi équivalent de 24 nM contre le variant de fusion oncogène de la kinase du lymphome anaplasique (ALK) de la nucléophosmine (NPM) exprimé par la lignée cellulaire de lymphome anaplasique à grandes cellules (ALCL) humaine KARPAS299. Le PF-2341066 inhibe les phénotypes néoplasiques dépendants de c-Met des cellules cancéreuses et les phénotypes angiogéniques des cellules endothéliales. Le PF-2341066 supprime la croissance des cellules de carcinome gastrique humain GTL-16 avec un IC50 de 9,7 nM. Le PF-2341066 induit l'apoptose dans les cellules GTL-16 avec un IC50 de 8,4 nM. Le PF-2341066 inhibe la migration et l'invasion des cellules de carcinome pulmonaire humain NCI-H441 stimulées par le HGF avec des IC50 de 11 nM et 6,1 nM, respectivement. Le PF-2341066 inhibe la dispersion des cellules MDCK avec un IC50 de 16 nM. Le PF-2341066 prévient la phosphorylation de c-Met stimulée par le HGF, la survie cellulaire et l'invasion du Matrigel avec des IC50 de 11 nM, 14 nM et 35 nM, respectivement. De plus, le PF-2341066 prévient la tubulogenèse de ramification des HMVEC stimulée par le sérum (formation de tubes vasculaires) dans des gels de fibrine.[4]

Dans le modèle GTL-16, le PF-2341066 révèle la capacité à provoquer une régression marquée des grandes tumeurs établies (>600 mm3) dans les cohortes de traitement de 50 mg/kg/jour et 75 mg/kg/jour, avec une diminution de 60 % du volume tumoral moyen sur le programme d'administration de 43 jours. Dans une autre étude, le PF-2341066 présente la capacité à inhiber complètement la croissance tumorale GTL-16 pendant >3 mois, avec seulement 1 souris sur 12 présentant une augmentation significative de la croissance tumorale sur le programme de traitement de 3 mois à 50 mg/kg/jour. Dans le modèle NSCLC NCI-H441, une diminution de 43 % du volume tumoral moyen est observée à 50 mg/kg/jour pendant le cycle d'administration de 38 jours de PF-2341066. Dans le modèle RCC Caki-1, une diminution de 53 % du volume tumoral moyen est observée, associée à une diminution du volume de chaque tumeur d'au moins 30 % à 50 mg/kg/jour pendant le cycle d'administration de 33 jours de PF-2341066. Le PF-2341066 révèle également une prévention quasi complète de la croissance des tumeurs établies à 50 mg/kg/jour dans les modèles de xénogreffe de glioblastome U87MG ou de carcinome de la prostate PC-3, avec respectivement 97 % ou 84 % d'inhibition le dernier jour de l'étude. En revanche, le PF-2341066 administré par voie orale à 50 mg/kg/jour n'inhibe pas significativement la croissance tumorale dans le modèle de carcinome mammaire MDA-MB-231 ou le modèle de carcinome du côlon DLD-1. Une réduction significative dose-dépendante des cellules endothéliales CD31-positives est observée à 12,5 mg/kg/jour, 25 mg/kg/jour et 50 mg/kg/jour dans les tumeurs GTL-16, indiquant que l'inhibition de la MVD montre une corrélation dose-dépendante avec l'efficacité antitumorale. Le PF-2341066 présente une réduction significative dose-dépendante des niveaux plasmatiques humains de VEGFA et d'IL-8 dans les modèles GTL-16 et U87MG. Une inhibition marquée des niveaux de c-Met, Akt, Erk, PLCλ1 et STAT5 phosphorylés est observée dans les tumeurs GTL-16 après administration orale de PF-2341066.[4]

• Tests ELISA de phosphorylation des kinases cellulaires

  Les cellules sont ensemencées dans des plaques à 96 puits dans un milieu supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et transférées dans un milieu sans sérum [avec 0,04 % d'albumine sérique bovine (BSA)] après 24 h. Dans les expériences étudiant la phosphorylation des RTK dépendante du ligand, les facteurs de croissance correspondants sont ajoutés pendant une durée maximale de 20 min. Après incubation des cellules avec le PF-2341066 pendant 1 h et/ou les ligands appropriés pendant les temps désignés, les cellules sont lavées une fois avec du HBSS supplémenté avec 1 mM de Na₃VO₄, et des lysats protéiques sont générés à partir des cellules. Par la suite, la phosphorylation des kinases protéiques sélectionnées est évaluée par une méthode ELISA en sandwich utilisant des anticorps de capture spécifiques utilisés pour enrober les plaques à 96 puits et un anticorps de détection spécifique des résidus de tyrosine phosphorylés. Les plaques recouvertes d'anticorps sont (a) incubées en présence de lysats protéiques à 4 °C pendant la nuit ; (b) lavées sept fois dans 1 % de Tween 20 dans du PBS ; (c) incubées dans un anticorps anti-total-phosphotyrosine (PY-20) conjugué à la peroxydase de raifort (1:500) pendant 30 min ; (d) lavées sept fois à nouveau ; (e) incubées dans un substrat de peroxydase de 3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine pour initier une réaction colorimétrique qui est arrêtée par l'ajout de 0,09 N H₂SO₄ ; et (f) mesurées pour l'absorbance à 450 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.

• Lignées cellulaires

  GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells

• Concentrations

  0-256 nM

• Temps dincubation

  1 h

• Méthode

  Cells including GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells are seeded in 96-well plates in media supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and transferred to serum-free media [with 0.04% bovine serum albumin (BSA)] after 24 hours. In experiments investigating ligand-dependent RTK phosphorylation, corresponding growth factors are added for up to 20 minutes. After incubation of cells with PF-2341066 for 1 hour and/or appropriate ligands for the designated times, cells are washed once with HBSS supplemented with 1 mM Na₃VO₄, and protein lysates are generated from cells. Subsequently, phosphorylation of selected protein kinases is assessed by a sandwich ELISA method using specific capture antibodies used to coat 96-well plates and a detection antibody specific for phosphorylated tyrosine residues. Antibody-coated plates are (a) incubated in the presence of protein lysates at 4 °C overnight; (b) washed seven times in 1% Tween 20 in PBS; (c) incubated in a horseradish peroxidase–conjugated anti–total-phosphotyrosine (PY-20) antibody (1:500) for 30 min; (d) washed seven times again; (e) incubated in 3,3^′,5,5^′-tetramethyl benzidine peroxidase substrate to initiate a colorimetric reaction that is stopped by adding 0.09 N H₂SO₄; and (f) measured for absorbance in 450 nm using a spectrophotometer.

• Modèles animaux

  Female or male nu/nu mice bearing NCI-H441,or DLD-1, or MDA-MB-231

• Dosages

  12.5 mg/kg/day, 25 mg/kg/day, and 50 mg/kg/day

• Administration

  p.o.