CHIR-124

CHIR-124 est une petite molécule à base de quinolone structurellement non apparentée à d'autres inhibiteurs connus de Chk1. Ce composé interagit de manière synergique avec les poisons de la topoisomérase (par exemple, la Camptothécine ou le SN-38) en provoquant une inhibition de la croissance dans diverses lignées cellulaires cancéreuses, y compris le carcinome mammaire (MDA-MB-231 et MDA-MB-435) et le carcinome du côlon (SW-620 et Colo205), qui contiennent toutes le gène p53 mutant. Il abroge les points de contrôle S et G2-M induits par le SN-38 et potentialise l'apoptose dans les cellules cancéreuses du sein MDA-MD-435. L'abrogation du point de contrôle G2-M et l'induction de l'apoptose par ce produit chimique sont améliorées par la perte de p53. [1] Ce composé cible également puissamment d'autres kinases telles que PDGFR et Flt3 avec un IC50 de 6,6 nM et 5,8 nM, respectivement. [2]

CHIR-124 potentialise les effets inhibiteurs de la croissance en abrogeant le point de contrôle G₂-M et en augmentant l'apoptose tumorale dans un modèle de xénogreffe de cancer du sein orthotopique.

• Chk1 Assay

  Pour le dosage de Chk1, le domaine kinase est exprimé dans des cellules d'insectes Sf9, et un peptide cdc25c biotinylé contenant le site de phosphorylation consensus Chk1/Chk2 (*) (biotine-[AHX]SGSGS*GLYRSPSMP-ENLNRPR[CONH2]) est utilisé comme substrat. Une série de dilutions de CHIR-124 est mélangée avec un tampon de réaction kinase contenant une concentration finale de 30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 4 mM EDTA, 25 mM R-glycérophosphate, 5 mM MnCl₂, 0,01 % d'albumine sérique bovine, 1,35 nM de domaine kinase CHK1, 0,5 μM de substrat peptidique et 1 AM d'ATP non marqué, plus 5 nM d'ATP marqué au ³³Pγ (activité spécifique = 2 000 Ci/mmol). Les réactions et la détection du transfert de phosphate sont effectuées par une méthode radioactive. Les réactions sont incubées à température ambiante pendant 1 à 4 heures et le peptide phosphorylé est capturé sur des plaques de microtitration revêtues de streptavidine contenant un tampon de réaction d'arrêt (25 mM EDTA [acide éthylènediaminetétraacétique], 50 mM HEPES, pH 7,5). Le peptide phosphorylé est mesuré avec le système DELFIA TRF en utilisant un anticorps anti-phosphotyrosine marqué au europium PT66. La concentration de ce composé pour l'IC50 est calculée par régression non linéaire avec le logiciel d'analyse de données XL-Fit.

• Lignées cellulaires

  MDA-MB-231, MDA-MB-435, SW-620, and COLO 205 cells

• Concentrations

  0-2350 nM, dependent on cell types

• Temps dincubation

  48 hours

• Méthode

  MDA-MB-231, MDA-MB-435, SW-620, and COLO 205 cells in log-phase are plated into 96-well microplates. CHIR-124 is serially diluted in the presence of six different concentrations of Camptothecin or 0 nM camptothecin. Camptothecin is also serially diluted in the absence of this compound. This chemical is added to cells in 96-well dishes and incubated at 37 °C for 48 hours. Each treatment condition is done in triplicate. Cell proliferation is monitored by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), inner salt assay. MTS inner salt is added to the microplates, which are incubated for another 3 hours, and absorbance at 490 nm is read on a plate reader. The concentrations of each drug in the combinations required to produce 50% inhibition are plotted to generate the isoboles. Isobologram analysis of drug interaction is based the equation of Loewe additivity (1= D _A /IC50, _A + D_B/IC50, _B), where IC50, _A and IC50, _B are the concentrations of drugs to result in 50% inhibition for each drug alone, and D_A and D_B are concentrations of each drug in the combination that yield 50% overall inhibition. A diagonal line indicating Loewe additivity is included in each graph. Data points that fall below the line indicate synergy, whereas those that fall above the line will indicate antagonism

• Modèles animaux

  MDA-MB-435 cells are implanted in the mammary fat pad of 8- to 10-week-old female immunodeficient mice.

• Dosages

  10 mg/kg or 20 mg/kg

• Administration

  CHIR-124 is given orally four times daily × 6 on days 2 to 7 in captisol.