Tivantinib

Il a été démontré qu'ARQ-197 prévient les réponses cellulaires induites par HGF/c-Met in vitro. Ce composé possède une activité antitumorale ; il inhibe la prolifération des cellules A549, DBTRG et NCI-H441 avec des IC50 de 0,38, 0,45, 0,29 μM. Le traitement avec cet agent entraîne une diminution de la phosphorylation de la cascade de signalisation MAPK et la prévention de l'invasion et de la migration. De plus, l'expression ectopique de c-Met dans NCI-H661, une lignée cellulaire n'ayant pas d'expression endogène de c-Met, lui confère un phénotype invasif qui est également supprimé par cette substance chimique. Bien que l'ajout de concentrations croissantes de cet inhibiteur n'affecte pas significativement le K_m de l'ATP, l'exposition de c-Met à 0,5 μM de cette substance a diminué la V_max de c-Met d'environ 3 fois. La capacité de cette molécule à diminuer la V_max sans affecter le Km de l'ATP a confirmé qu'elle inhibe c-Met par un mécanisme non compétitif de l'ATP et peut donc expliquer son haut degré de sélectivité de la Protein Tyrosine Kinase. Elle prévient le c-Met recombinant humain avec une constante inhibitrice calculée K_i d'environ 355 nM. Bien que la concentration la plus élevée d'ATP utilisée soit de 200 μM, la puissance de ce composé contre c-Met n'est pas réduite en utilisant des concentrations d'ATP allant jusqu'à 1 mM. Il bloque la phosphorylation de c-Met et les voies de signalisation c-Met en aval. Ce produit chimique supprime l'autophosphorylation constitutive et médiée par les ligands de c-Met et, par extension, l'activité de c-Met, ce qui entraîne à son tour l'inhibition des effecteurs c-Met en aval. Son induction de l'apoptose dépendante de la caspase est augmentée dans les cellules cancéreuses humaines exprimant c-Met, y compris les cellules HT29, MKN-45 et MDA-MB-231.[1][2]

Les trois modèles de xénogreffes traités avec Tivantinib présentent des réductions de la croissance tumorale : 66% dans le modèle HT29, 45% dans le modèle MKN-45 et 79% dans le modèle MDA-MB-231. Dans ces études de xénogreffes, aucun changement significatif de poids corporel n'est observé après administration orale de ce composé à 200 mg/kg. Sur le plan pharmacodynamique, la phosphorylation de c-Met dans les xénogreffes tumorales du côlon humain (HT29) est fortement inhibée par ce produit chimique, comme en témoigne une réduction spectaculaire de l'autophosphorylation de c-Met 24 heures après une dose orale unique de 200 mg/kg de cet agent. Ce même dosage chez la souris montre que les xénogreffes tumorales sont exposées à des niveaux plasmatiques soutenus du composé, ce qui est cohérent avec l'inhibition pharmacodynamique observée de la phosphorylation de c-Met et l'inhibition de la prolifération des lignées cellulaires cancéreuses hébergeant c-Met. Les niveaux plasmatiques de l'agent 10 heures après l'administration sont déterminés à 1,3 μM, soit plus de 3 fois la constante inhibitrice biochimique de cette substance pour c-Met. Par conséquent, il est capable de supprimer sa cible in vivo dans le tissu tumoral humain xénogreffé. En conclusion, cet inhibiteur bloque la croissance des tumeurs humaines xénogreffées dépendantes de c-Met.[1]

• Essai kinase in vitro SDS-PAGE c-Met

  La protéine c-Met recombinante (100 ng) est pré-incubée avec des concentrations croissantes de ce composé pendant 30 minutes à température ambiante. Après la pré-incubation, 100 μM de substrat poly-Glu-Tyr et diverses concentrations d'ATP contenant 5 μCi de [γ-32P]ATP sont ajoutés au mélange réactionnel. La réaction est incubée pendant 5 minutes à température ambiante, puis arrêtée par l'ajout de 5 μL de gel SDS-polyacrylamide, tampon d'échantillon réducteur. Les échantillons sont ensuite chargés sur un gel d'acrylamide à 7,5% et un SDS-PAGE est effectué. Les substrats poly-Glu-Tyr phosphorylés sont finalement visualisés par autoradiographie. L'activité c-Met est quantifiée par densitométrie.

• Lignées cellulaires

  T29, MKN-45 and MDA-MB-231 cells

• Concentrations

  0.03-10 μM

• Temps dincubation

  24, 32, and 48 hours

• Méthode

  HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are seeded in black 96-well plates at 5 × 10³ cells per well overnight in a medium with 10% FBS. The next day, cells are treated with increasing concentrations of this compound (0.03-10 μM) for 24, 32, and 48 hours at 37 °C. After this compound treatment, the drug-containing medium is removed and cells are incubated for at least 10 minutes in a labeling solution (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, and 6 mM CaCl₂) containing 2 μg/mL Hoescht 33342 (blue channel), 500-times diluted Annexin V-FITC (green channel), and 1 μg/mL propidium iodide (red channel). High-content image acquisition and analysis are carried out. The program is set to take four images per well. The exposure time is set at 16.7 ms/10% gain, 500 ms/35% gain, and 300 ms/30% gain for the 4,6-diamidino-2-phenylindole, FITC, and rhodamine channels, respectively. Images are processed and the numbers of positive cells for each channel and each condition are determined. In addition, HT29 cells are treated with increasing concentrations of this compound for 32 hours in the absence or the presence of 25, 50, and 100 μM ZvAD-FMK (irreversible general caspase inhibitor), and the same procedures are undertaken. All experiments are done in triplicate. To determine whether the apoptotic effect is due to c-Met inhibition, the effect of this compound when glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and c-Met are knocked down using siRNA is investigated. HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are transfected with a nontargeted control siRNA, a gapgh-targeted control siRNA, or a met-targeted siRNA. After 3 days, c-Met, GAPDH, and β-actin expression levels are determined using specific antibodies. To determine if the effect is caspase dependent, HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are transfected with a met-targeted siRNA for 2 days and incubated in the absence or the presence of increasing concentrations of ZvAD-FMK for 1 additional day. A nontargeted siRNA and a gapgh-targeted siRNA (siRNA GAPDH) are also transfected in parallel, as controls. Cells are then stained with Annexin V-FITC and propidium iodide, and the percentage of apoptotic cells is determined.

• Modèles animaux

  Female athymic nude mice bearing HT29, MKN-45, or MDA-MB-231 tumor xenografts

• Dosages

  200 mg/kg

• Administration

  Orally administered