Foretinib

L'inhibition de la kinase est étudiée en utilisant l'un des trois formats d'essai : transfert de [³³P]phosphoryl, chimioluminescence couplée à la luciférase, ou technologie AlphaScreen tyrosine kinase. Les IC50 sont calculées par analyse de régression non linéaire à l'aide de XLFit.³³P -Transfert de Phosphoryl Essai Kinase Les réactions sont effectuées dans des plaques de microtitration à 384 puits, blanches, à fond transparent, à forte liaison (Greiner, Monroe, NC). Les plaques sont revêtues de 2 / L/puits de protéine ou de substrat peptidique dans un volume de 50 / L de tampon de revêtement contenant 40 / L/mL de substrat (poly(Glu, Tyr) 4:1, 22,5 mM Na2CO₃, 27,5 mM NaHCO₃, 50 mM NaCl et 3 mM NaN ₃. Les plaques revêtues sont lavées une fois avec 50 / L de tampon d'essai après incubation d'une nuit à température ambiante (TA). Les composés tests et les enzymes sont combinés avec ³³P- - ATP (3,3 / Ci/nmol) dans un volume total de 20 / L. Le mélange réactionnel est incubé à TA pendant 2 heures et arrêté par aspiration. Les plaques de microtitration sont ensuite lavées 6 fois avec un tampon Tween-PBS à 0,05% (PBST). Un liquide de scintillation (50 / L/puits) est ajouté et le ³³P incorporé est mesuré par spectrométrie de scintillation liquide à l'aide d'un compteur de scintillation MicroBeta.Essai de Chimioluminescence Couplée à la Luciférase Les réactions sont menées dans des plaques de microtitration à 384 puits, blanches, à liaison moyenne (Greiner). Dans une première étape, l'enzyme et le composé sont combinés et incubés pendant 60 minutes ; les réactions sont initiées par addition d'ATP et de substrat peptidique (poly(Glu, Tyr) 4:1) dans un volume final de 20 / L, et incubées à TA pendant 2-4 heures. Après la réaction de la kinase, une aliquote de 20 / L de Kinase Glo (Promega, Madison, WI) est ajoutée et le signal de luminescence est mesuré à l'aide d'un lecteur de plaques Victor. La consommation totale d'ATP est limitée à 50%. Essai AlphaScreenTM Tyrosine Kinase Des billes donneuses revêtues de streptavidine et des billes accepteuses revêtues d'anticorps anti-phosphotyrosine PY100 sont utilisées. Le poly(Glu,Tyr) 4:1 biotinylé est utilisé comme substrat. La phosphorylation du substrat est mesurée par addition de billes donneuses/accepteuses par luminescence après la formation du complexe bille donneuse-accepteuse. La kinase et les composés tests sont combinés et pré-incubés pendant 60 minutes, suivis de l'addition d'ATP et de poly(Glu, Tyr) biotinylé dans un volume total de 20 / L dans des plaques de microtitration à 384 puits, blanches, à liaison moyenne (Greiner). Les mélanges réactionnels sont incubés pendant 1 heure à température ambiante. Les réactions sont arrêtées par addition de 10 / L de 15-30 / L/mL de suspension de billes AlphaScreen contenant 75 mM Hepes, pH 7,4, 300 mM NaCl, 120 mM EDTA, 0,3% BSA et 0,03% Tween-20. Après 2-16 heures d'incubation à température ambiante, les plaques sont lues à l'aide d'un lecteur AlphaQuest.

B16F10, A549, and HT29 cells

40 nM

12 to 14 days

B16F10, A549, and HT29 cells (1.2× 10³ per well) are mixed with soft agar and seeded in a 96-well plate containing 10% FBS and EXEL-2880 over a base agar layer. For normoxic conditions, the plates are incubated (37°C) for 12 to 14 days in 21% oxygen, 5% CO₂, and 74% nitrogen, whereas incubation (37 °C) under hypoxic conditions is done in a hypoxia chamber in 1% oxygen, 5% CO₂, and 94% nitrogen. The number of colonies is evaluated under each condition following addition of 50% Alamar Blue and fluorescence detection.

B16F10 tumor cells (2 × 10 ⁵) are implanted via i.v. tail vein injection into athymic nude mice (NCr or BALB/c) 5 to 8 weeks old

100 mg/kg

Administered via oral gavage