Tandutinib (MLN518)

Tandutinib (MLN518) a peu d'activité contre l'EGFR, le FGFR, le KDR, l'InsR, le Src, l'Abl, la PKC, la PKA et les MAPK. Il inhibe la croissance cellulaire indépendante de l'IL-3 et l'autophosphorylation de FLT3-ITD avec une IC50 de 10-100 nM. Ce composé inhibe également la prolifération des cellules de leucémie humaine Ba/F3 contenant des mutations FLT3-ITD avec des valeurs d'IC50 de 10-30 nM, et des cellules Molm-13 et Molm-14 positives pour FLT3-ITD avec une IC50 de 10 nM. Dans les cellules Molm-14 positives pour FLT3-ITD, mais pas les cellules THP-1 négatives pour FLT3-ITD, le traitement par Tandutinib entraîne une apoptose significative de 51 % et 78 % à 24 et 96 heures, respectivement, en raison d'une inhibition spécifique de FLT3. [1] Il inhibe préférentiellement la croissance des colonies de blastes de patients atteints de LAM positifs pour FLT3 ITD par rapport aux patients ITD-négatifs, sans affecter la formation de colonies par les cellules progénitrices humaines normales. [2]

L'administration orale de Tandutinib (MLN518) à 60 mg/kg deux fois par jour augmente significativement la survie chez les souris porteuses de cellules Ba/F3 exprimant le mutant W51 FLT3-ITD, et entraîne une réduction significative de la mortalité dans un modèle de transplantation de moelle osseuse chez la souris. [1] Le traitement avec ce composé à 180 mg/kg deux fois par jour a une légère toxicité pour l'hématopoïèse normale, cependant, c'est une dose à laquelle il est efficace dans le traitement de la leucémie FLT3 ITD-positive chez la souris. [2]

• Tests d'autophosphorylation des récepteurs basés sur les cellules

  Les tests d'autophosphorylation de la kinase de la famille PDGFR sont des tests ELISA (enzyme-linked immunosorbent) basés sur des cellules utilisant des cellules CHO exprimant le PDGFRβ de type sauvage, la protéine chimérique PDGFRβ/c-Kit et PDGFRβ/Flt3 qui contiennent les domaines extracellulaire et transmembranaire du PDGFRβ et le domaine cytoplasmique du c-Kit et de Flt-3. Les cellules sont cultivées jusqu'à confluence dans des plaques de microtitration à 96 puits dans des conditions de culture tissulaire standard, suivies d'une privation de sérum pendant 16 heures. Brièvement, les cellules quiescentes sont incubées à 37 °C avec des concentrations croissantes de Tandutinib (MLN518) pendant 30 minutes, suivies de l'ajout de 8 nM de PDGF-BB pendant 10 minutes. Les cellules sont lysées dans 100 mM Tris, pH 7,5, 750 mM NaCl, 0,5 % Triton X-100, 10 mM pyrophosphate de sodium, 50 mM NaF, 10 μg/mL leupeptine, 1 mM phénylméthylsulfonylfluorure, 1 mM vanadate de sodium, et le lysat est clarifié par centrifugation à 15 000 g pendant 5 minutes. Les lysats clarifiés sont transférés dans une deuxième plaque de microtitration dont les puits ont été préalablement recouverts de 500 ng/puits de mAb anti-PDGFRβ 1B5B11, puis incubés pendant 2 heures à température ambiante. Après trois lavages avec un tampon de liaison (0,3 % de gélatine, 25 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,01 % Tween 20), 250 ng/mL d'anticorps polyclonaux anti-phosphotyrosine de lapin sont ajoutés et les plaques sont incubées à 37 °C pendant 60 minutes. Ensuite, chaque puits est lavé trois fois avec un tampon de liaison et incubé avec 1 μg/mL d'anticorps anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort à 37 °C pendant 60 minutes. Les puits sont lavés avant d'ajouter 2,2

• Lignées cellulaires

  Ba/F3, Molm-13, Molm-14, HL60, AML193, KG-1, KG-1a, THP-1, and RS4;11

• Concentrations

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~30 μM

• Temps dincubation

  ~7 days

• Méthode

  Cells are exposed to increasing concentrations of Tandutinib (MLN518) (0.004-30 μM). They are grown for 3-7 days in tissue culture, and viable cells, determined by Trypan blue dye exclusion, are counted. At daily intervals, cells are harvested, washed, and resuspended in 100 uL binding buffer containing 10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, and 2.5 mM CaCl₂. Annexin V-FITC (100 ng) and propidium iodide (250 ng) are added to the cell suspension followed by incubation at room temperature for 15 minutes. Flow cytometry is performed immediately after staining on a FACSort flow cytometer with excitation at 488 nm. Fluorescence of annexin V-FITC and DNA propidium iodide staining are measured at 515 nm and 585 nm, respectively.

• Modèles animaux

  Female athymic nude (nu/nu) mice injected with Ba/F3 cells expressing W51 FLT3-ITD mutant

• Dosages

  40-120 mg/kg/day

• Administration

  Orally by gavage