Sorafenib Tosylate (BAY 43-9006)

Le tosylate de Sorafenib inhibe l'activité de B-Raf de type sauvage et de type mutant V599E avec des IC50 de 22 nM et 38 nM, respectivement. Ce composé inhibe également puissamment mVEGFR2 (Flk-1), mVEGFR3, mPDGFRβ, Flt3 et c-Kit avec des IC50 de 15 nM, 20 nM, 57 nM, 58 nM et 68 nM, respectivement. Il inhibe faiblement FGFR-1 avec une IC50 de 580 nM. Ce produit chimique n'est pas actif contre ERK-1, MEK-1, EGFR, HER-2, IGFR-1, c-Met, PKB, PKA, cdk1/cyclinB, PKCα, PKCγ et pim-1. Il inhibe de manière significative la phosphorylation de VEGFR2 dans les cellules NIH 3T3 avec une IC50 de 30 nM et la phosphorylation de Flt-3 dans les cellules HEK-293 avec une IC50 de 20 nM. Il bloque puissamment la phosphorylation de MEK 1/2 et ERK 1/2 dans la plupart des lignées cellulaires mais pas dans les cellules A549 ou H460, tout en n'ayant aucun effet sur l'inhibition de la voie PKB. Il inhibe la prolifération des cellules HAoSMC et MDA-MB-231 avec des IC50 de 0,28 μM et 2,6 μM, respectivement. [1] En plus de l'inhibition de la voie de signalisation RAF/MEK/ERK, il inhibe significativement la phosphorylation de eIF4E et régule à la baisse les niveaux de Mcl-1 dans les cellules de carcinome hépatocellulaire (HCC) de manière indépendante de MEK/ERK. Il inhibe la prolifération des cellules PLC/PRF/5 et HepG2 avec des IC50 de 6,3 μM et 4,5 μM, respectivement, et entraîne une induction significative de l'apoptosis. [2]

L'administration orale de Sorafenib tosylate (~60 mg/kg) démontre une activité antitumorale à large spectre et dose-dépendante contre une variété de modèles de xénogreffes tumorales humaines, y compris MDA-MB-231, Colo-205, HT-29, DLD-1, NCI-H460 et A549, sans preuve de toxicité. En association avec l'efficacité antitumorale, ce traitement par composé inhibe puissamment la phosphorylation de MEK 1/2 et les niveaux de pERK 1/2 dans les xénogreffes HT-29 et MDA-MB-231, mais pas dans les xénogreffes Colo-205, et supprime significativement la surface des microvaisseaux tumoraux (MVA) et la densité des microvaisseaux (MVD) dans les xénogreffes tumorales MDA MB-231, HT-29 et Colo-205. [1] Ce traitement par composé produit une inhibition de la croissance dose-dépendante des xénogreffes tumorales PLC/PRF/5 chez les souris SCID avec des TGI de 49% et 78% à 10 mg/kg et 30 mg/kg, respectivement, ce qui est cohérent avec l'inhibition de la phosphorylation d'ERK et d'eIF4E, la réduction de la surface des microvaisseaux et l'induction de l'apoptosis des cellules tumorales. [2]

• Tests biochimiques

  Les baculovirus recombinants exprimant Raf-1 (résidus 305–648) et B-Raf (résidus 409–765) sont purifiés sous forme de protéines de fusion. Le MEK-1 humain pleine longueur est généré par PCR et purifié sous forme de protéine de fusion à partir de lysats d'Escherichia coli. Sorafenib tosylate est ajouté à un mélange de Raf-1 (80 ng), ou B-Raf (80 ng) avec MEK-1 (1 μg) dans un tampon d'essai [20 mM Tris (pH 8.2), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, et 0,15% β-mercaptoéthanol] à une concentration finale de 1% de DMSO. L'essai de la kinase Raf (volume final de 50 μL) est initié par l'ajout de 25 μL de 10 μM γ[³³P]ATP (400 Ci/mol) et incubé à 32 °C pendant 25 minutes. Le MEK-1 phosphorylé est récolté par filtration sur un tapis de phosphocellulose, et 1% d'acide phosphorique est utilisé pour éliminer la radioactivité non liée. Après séchage par chauffage micro-ondes, un compteur à plaque β est utilisé pour quantifier la radioactivité liée au filtre. Le domaine kinase de VEGFR2 (KDR) humain est exprimé et purifié à partir de lysats de Sf9. Des essais de transfert d'énergie par fluorescence résolue dans le temps pour VEGFR2 sont effectués dans des plaques opaques à 96 puits au format de transfert d'énergie par fluorescence résolue dans le temps. Les conditions de réaction finales sont les suivantes : 1 à 10 μM ATP, 25 nM poly GT-biotine, 2 nM anticorps phospho (p)-Tyr marqué à l'europium (PY20), 10 nM APC, 1 à 7 nM domaine kinase cytoplasmique à des concentrations finales de 1% de DMSO, 50 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 0,1 mM EDTA, 0,015% Brij-35, 0,1 mg/mL BSA, et 0,1% β-mercaptoéthanol. Les volumes de réaction sont de 100 μL et sont initiés par l'ajout d'enzyme. Les plaques sont lues à la fois à 615 et 665 nM sur un compteur Multilabel Perkin-Elmer VictorV environ 1,5 à 2,0 heures après l'initiation de la réaction. Le signal est calculé comme un rapport : (665 nm/615 nM) × 10 000 pour chaque puits. Pour la génération de l'IC50, ce composé est ajouté avant l'initiation de l'enzyme. Une plaque de stock 50 fois est préparée avec ce produit chimique dilué en série au 1:3 dans une solution de 50% de DMSO/50% d'eau distillée. Les concentrations finales de ce composé varient de 10 μM à 4,56 nM dans 1% de DMSO.

• Lignées cellulaires

  MDA-MB-231, and HAoSMC

• Concentrations

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Temps dincubation

  72 hours

• Méthode

  Cells are exposed to increasing concentrations of Sorafenib tosylate for 72 hours. Cell number is quantitated using the Cell TiterGlo ATP Luminescent assay kit. This assay measures the number of viable cells per well by measurement of luminescent signal based on amount of cellular ATP.

• Modèles animaux

  Female NCr-nu/nu mice implanted s.c. with MDA-MB-231, Colo-205, HT-29, H460, or A549 cells

• Dosages

  ~60 mg/kg

• Administration

  Orally once daily