Raltegravir

Pour les essais quantitatifs de transfert de brin, le substrat d'ADN donneur est formé par l'hybridation d'oligonucléotides de qualité HPLC 5 -GACTCACTATAGGGCACGCGTCAAAATTCCATGACA et 5 -ATTGTCATG GAATTTTGACGCGTGCCCTATAGTGAGTC. Les réactions (40 L) contiennent 0,75 M de PFV IN, 0,75 M d'ADN donneur, 4 nM (300 ng) d'ADN cible pGEM9-Zf( ) surenroulé, 125 mM de NaCl, 5 mM de MgSO , 4 M de ZnCl , 10 mM de DTT, 0,8 % (v/v) de DMSO et 25 mM de BisTris propane HCl, pH 7,45. Raltegravir est ajouté aux concentrations indiquées. Les réactions sont initiées par l'ajout de 2 L de PFV IN dilué dans 150 mM de NaCl, 2 mM de DTT et 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, et arrêtées après 1 heure à 37 °C par l'ajout de 25 mM d'EDTA et 0,5 % (p/v) de SDS. Les produits de réaction, déprotéinés par digestion avec 20 g de protéinase K pendant 30 minutes à 37 °C suivie d'une précipitation à l'éthanol, sont séparés dans des gels d'agarose à 1,5 % et visualisés par coloration au bromure d'éthidium. Les produits d'intégration sont quantifiés par PCR quantitative en temps réel, en utilisant le Platinum SYBR Green qPCR SuperMix et trois amorces : 5 -CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAAC, 5 -TTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAAC et 5 -GACTCACTATAGGGCACGCGT. Les réactions de PCR (20 L) contiennent 0,5 M de chaque amorce et 1 L de produit de réaction d'intégration dilué. Après une étape de dénaturation de 5 minutes à 95 °C, 35 cycles sont effectués dans un instrument PCR CFX96, avec 10 secondes de dénaturation à 95 °C, 30 secondes d'hybridation à 56 °C et 1 minute d'extension à 68 °C. Des courbes standard sont générées en utilisant des dilutions en série de la réaction de la PFV IN WT en l'absence de ce composé.

Human MT-4 cells

0.0001-1 μM

5 days

Human MT-4 cells are infected for 2 hours with the SIVmac251, HIV-1 (IIIB) and HIV-2 (CDC 77618) stocks at a multiplicity of infection of, approximately, 0.1. Cells are then washed three times in phosphate buffered saline, and suspended at 5 × 10⁵/mL in fresh culture medium (to primary cells 50 units/mL of IL-2 are added) in 96-well plates, in the presence or absence of a range of triplicate raltegravir concentrations (0.0001 μM -1 μM). Untreated infected and mock-infected controls are prepared too, in order to allow comparison of the data derived from the different treatments. Viral cytopathogeniciy in MT-4 cells is quantitated by the methyl tetrazolium (MTT) method (MT-4/MTT assay) when extensive cell death in control virus-infected cell cultures is detectable microscopically as lack of capacity to re-cluster. The capability of MT-4 cells to form clusters after infection. Briefly, clusters are disrupted by pipetting; and, after 2 hours of incubation at 37 °C, the formation of new clusters is assessed by light microscopy (100 × magnification). Cell culture supernatants are collected for HIV-1 p24 and HIV-2/SIVmac251 p27 core antigen measurement by ELISA. In CEMx174-infected cell cultures, which show a propensity to form syncytia induced by the virus envelope glycoproteins, syncytia are counted, in blinded fashion, by light microscopy for each well at 5 days following infection.

Indian Rhesus macaques

50 mg/kg or 100 mg/kg

Oral administration