CP-724714

Le CP-724,714 est marqué sélectivement contre EGFR avec un IC50 de 6,4 M. Le CP-724,714 est >1 000 fois moins puissant pour IR, IGF-1R, PDGFR V, VGFR2, abl. Src, c-Met c-jun NH2-terminal kinase (JNK)-2, JNK-3, ZAP-70, cycline-dependent kinase (CDK)-2 et CDK-5. Le CP-724,714 réduit puissamment l'autophosphorylation induite par l'EGF de la chimère contenant le domaine kinase erbB2 avec un IC50 de 32 nM, mais est nettement moins puissant contre l'EGFR dans les cellules NIH3T3 transfectées. Le CP-724,714 inhibe de manière sensible la prolifération des cellules amplifiées en erbB2, y compris BT-474 et SKBR3, avec un IC50 de 0,25 et 0,95 M. Le CP-724,714 induit l'accumulation de cellules en phase G1 et une réduction marquée de la phase S dans les cellules BT-474 à 1 M. [1] Le CP-724,714 exerce probablement son hépatotoxicité via des lésions hépatocellulaires et des mécanismes cholestatiques hépatobiliaires. Le CP-724,714 inhibe l'efflux de cholyl-lysyl et de taurocholate (TC) dans les canalicules des hépatocytes humains cryoconservés et frais cultivés, respectivement. Le CP-724,714 inhibe le transport de TC dans les vésicules membranaires exprimant la pompe d'exportation des sels biliaires humains avec un IC50 de 16 M et inhibe le principal transporteur d'efflux dans les canalicules biliaires, MDR1, avec un IC50 d'environ 28 M. [2]

Le CP-724,714 (25 mg/kg) est rapidement absorbé après administration p.o. et provoque une réduction de la phosphorylation du récepteur erbB2 tumoral après administration dans des xénogreffes FRE-erbB2 ou BT-474. Le CP-724,714 induit l'apoptose chez les souris (s.c.) porteuses de xénogreffes FRE-erbB2 et montre une inhibition de 50 % de la croissance tumorale à 50 mg/kg, sans perte de poids ni mortalité. Le CP-724,714 a également une grande activité antitumorale dans les xénogreffes MDA-MB-453, MDA-MB-231, LoVo (côlon) et Colo-205 (côlon). De plus, le CP-724,714 (30 ou 100 mg/kg) réduit la kinase régulée par le signal extracellulaire et la phosphorylation d'Akt dans les xénogreffes BT-474. [1]

• Essais kinases

  Les domaines intracellulaires recombinants d'erbB2 (résidus d'acides aminés 675-1255) et d'EGFR (résidus d'acides aminés 668-1211) sont exprimés dans des cellules Sf9 infectées par le baculovirus sous forme de protéines de fusion S-transférase. Les protéines sont purifiées par chromatographie d'affinité sur des billes de Sepharose pour être utilisées dans l'essai. Des plaques Nunc MaxiSorp de 96 puits sont revêtues par incubation pendant une nuit à 37 °C avec 100 L/puits de 0,25 mg/mL de poly(Glu:Tyr, 4:1), PGT dans du PBS. L'excès de PGT est éliminé par aspiration et la plaque est lavée 3 fois avec du tampon de lavage (0,1 % de Tween 20 dans du PBS). La réaction de la kinase est effectuée dans 50 L de 50 mm HEPES (pH 7,4) contenant 125 mm de chlorure de sodium, 0,1 mm d'orthovanadate de sodium, 1 mm d'ATP et ~15 ng de protéine recombinante. Des inhibiteurs dans du DMSO sont ajoutés ; la concentration finale de DMSO est de 2,5 %. La phosphorylation est initiée par l'ajout d'ATP et se poursuit pendant 6 min à température ambiante, avec une agitation constante. La réaction de la kinase est arrêtée par aspiration du mélange réactionnel et lavage quatre fois avec du tampon de lavage. Le PGT phosphorylé est mesuré après une incubation de 25 min avec 50 L/puits d'anticorps anti-phosphotyrosine PY54 conjugué à la HRP, dilué à 0,2 g/mL dans du tampon de blocage (3 % de BSA, 0,05 % de Tween 20 dans du PBS). L'anticorps est éliminé par aspiration et la plaque est lavée quatre fois avec du tampon de lavage. Le signal colorimétrique est développé par l'ajout de 50 L/puits de substrat de peroxydase Tetramethylbenzidine Microwell et arrêté par l'ajout de 50 L/puits d'acide sulfurique 0,09 m. Le produit de phosphotyrosine formé est estimé par mesure de l'absorbance à 450 nm. Le signal pour les contrôles est typiquement A0,6 1,2, avec pratiquement aucun arrière-plan dans les puits sans ATP, protéine kinase ou PGT, et est proportionnel au temps d'incubation pendant 6 min.

• Lignées cellulaires

  ZR-75-30, HCC-1419, MDA-MB-175, BT-474, SKBR3, MDA-MB-361, UACC-812, T-47D, MDA-MB-453, MDA-MB-468, CAMA-1, MDA-MB-157, MCF-7, MDA-MB-435, ZR-75-1, BT-20, and MDA-MB-231.

• Concentrations

  0.1 nM - 10 μM.

• Temps dincubation

  6 to 7 days.

• Méthode

  Cells are seeded in duplicate at 5~10 × 10³ per well in 24-well plates. The day after plating, CP-724,714 is added by titrating over six or more dilutions from 0.1 nM to 10 μM. Control wells without CP-724,714 are seeded as well. Cells are grown for 6 to 7 days, at which time surviving cells are counted. After trypsinization, cells are placed in isotone solution and counted immediately using a Coulter Z2 particle counter. Growth inhibition is calculated [(1− experimental value / control value) × 100] for each concentration. Dose-response curves are repeated at least twice and averaged. IC50 values are calculated using Calcusyn Software.

• Modèles animaux

  FRE-erbB2 BT-474, MDA-MB-453, MDA-MB-231, LoVo (colon), and Colo-205 (colon) xenografts are established in athymic female mice (CD-1 nu/nu).

• Dosages

  ~100 mg/kg.

• Administration

  Administered via p.o.