Dovitinib (TKI-258)

Le Dovitinib (TKI-258) inhibe puissamment la croissance stimulée par le FGF des cellules B9 exprimant le WT et le F384L-FGFR3 avec une IC50 de 25 nM. De plus, il inhibe la prolifération des cellules B9 exprimant chacun des différents mutants activés de FGFR3. Il est intéressant de noter qu'il y a des différences minimales observées dans la sensibilité des différentes mutations de FGFR3 à ce composé, l'IC50 allant de 70 à 90 nM pour chacune des différentes mutations. Les cellules B9 dépendantes de l'IL-6 contenant uniquement un vecteur (cellules B9-MINV) sont résistantes à son activité inhibitrice à des concentrations allant jusqu'à 1 μM. Il inhibe la prolifération cellulaire des cellules KMS11 (FGFR3-Y373C), OPM2 (FGFR3-K650E) et KMS18 (FGFR3-G384D) avec une IC50 de 90 nM (KMS11 et OPM2) et 550 nM, respectivement. Le composé inhibe la phosphorylation d'ERK1/2 médiatisée par le FGF et induit une cytotoxicité dans les cellules MM primaires exprimant le FGFR3. Les BMSCs confèrent un degré modeste de résistance avec 44,6 % d'inhibition de la croissance pour les cellules traitées avec 500 nM de Dovitinib et cultivées sur stroma, comparativement à 71,6 % d'inhibition de la croissance pour les cellules cultivées sans BMSCs. Il inhibe la prolifération de M-NFS-60, une lignée cellulaire myéloblastique de souris dont la croissance est stimulée par le M-CSF, avec une concentration efficace médiane (EC50) de 220 nM. [1] Le traitement des cellules SK-HEP1 avec ce composé entraîne une réduction dose-dépendante du nombre de cellules et un arrêt en phase G2/M avec une réduction des phases G0/G1 et S, une inhibition de la croissance indépendante de l'ancrage et un blocage de la motilité cellulaire induite par le bFGF. L'IC50 pour ce composé dans les cellules SK-HEP1 est d'environ 1,7 μM. Il réduit également significativement les niveaux de phosphorylation basale de FGFR-1, du substrat 2α de FGFR (FRS2-α) et d'ERK1/2, mais pas d'Akt dans les cellules SK-HEP1 et 21-0208. Dans les cellules HCC 21-0208, il inhibe significativement la phosphorylation induite par le bFGF de FGFR-1, FRS2-α, ERK1/2 mais pas d'Akt. [2]

Le Dovitinib (TKI-258) induit des réponses cytostatiques et cytotoxiques in vivo, entraînant une régression des tumeurs exprimant FGFR3.[1] Il montre une inhibition dose- et exposition-dépendante des récepteurs tyrosine kinases (RTK) cibles exprimés dans les xénogreffes tumorales. Ce composé inhibe puissamment la croissance tumorale de six lignées de CHC. L'inhibition de l'Angiogenesis est corrélée à l'inactivation des voies de signalisation FGFR/PDGFR\[beta\]/VEGFR2. Dans un modèle orthotopique, il inhibe puissamment la croissance tumorale primaire et les métastases pulmonaires et prolonge significativement la survie des souris. [2] L'administration de Dovitinib entraîne une inhibition significative de la croissance tumorale et des régressions tumorales, y compris des tumeurs importantes et établies (500-1 000 mm³). [3]

• Essais de kinase in vitro

  Les valeurs de la concentration inhibitrice à 50 % (IC50) pour l'inhibition des RTK par Dovitinib (TKI-258) sont déterminées dans un format de fluorescence résolue en temps (TRF) ou radioactif, mesurant son inhibition du transfert de phosphate à un substrat par l'enzyme respective. Les domaines kinases de FGFR3, FGFR1, PDGFR\[beta\], et VEGFR1-3 sont testés dans 50 mM HEPES (acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N^\[prime\]-2-éthanesulfonique), pH 7.0, 2 mM MgCl\[subscript\]2\[/subscript\], 10 mM MnCl\[subscript\]2\[/subscript\] 1 mM NaF, 1 mM dithiothréitol (DTT), 1 mg/mL albumine de sérum bovin (BSA), 0.25 \[mu\]M substrat peptidique biotinylé (GGGGQDGKDYIVLPI), et 1 à 30 \[mu\]M adénosine triphosphate (ATP) en fonction du K\[subscript\]m\[/subscript\] de l'enzyme respective. Les concentrations d'ATP sont égales ou juste inférieures à K\[subscript\]m\[/subscript\]. Pour les réactions de c-KIT et FLT3, le pH est élevé à 7.5 avec 0.2 à 8 \[mu\]M ATP en présence de 0.25 à 1 \[mu\]M substrat peptidique biotinylé (GGLFDDPSYVNVQNL). Les réactions sont incubées à température ambiante pendant 1 à 4 heures et le peptide phosphorylé est capturé sur des plaques de microtitration revêtues de streptavidine contenant un tampon d'arrêt de réaction (25 mM EDTA \[acide éthylènediaminetétraacétique\], 50 mM HEPES, pH 7.5). Le peptide phosphorylé est mesuré avec le système DELFIA TRF utilisant un anticorps anti-phosphotyrosine PT66 marqué à l'Europium. La concentration de ce composé pour l'IC50 est calculée à l'aide d'une régression non linéaire avec le logiciel d'analyse de données XL-Fit version 4.1 (IDBS). L'inhibition de l'activité kinase du récepteur du facteur stimulant les colonies-1 (CSF-1R), de PDGFR\[alpha\], du récepteur de l'insuline (InsR) et du récepteur du facteur de croissance 1 de type insuline (IGFR1) est déterminée à des concentrations d'ATP proches du K\[subscript\]m\[/subscript\] pour l'ATP.

• Lignées cellulaires

  B9 cells, MM cell lines

• Concentrations

  100 nM

• Temps dincubation

  48-96 hours

• Méthode

  Cell viability is assessed by 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyl tetrazolium (MTT) dye absorbance. Cells are seeded in 96-well plates at a density of 5 × 10³ (B9 cells) or 2 × 10⁴ (MM cell lines) cells per well. Cells are incubated with 30 ng/mL aFGF and 100 μg/mL heparin or 1% IL-6 where indicated and increasing concentrations of Dovitinib (TKI-258). For each concentration of this compound, 10 μL aliquots of drug or DMSO diluted in culture medium is added. To evaluate its effect on growth of MM cells adherent to BMSCs, 10⁴ KMS11 cells are cultured on BMSC-coated 96-well plates in the presence or absence of it. Plates are incubated for 48 to 96 hours. For assessment of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)-mediated growth, 5 × 10³ M-NFS-60 cells/well are incubated with serial dilutions of it with 10 ng/mL M-CSF and without granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). After 72 hours cell viability is determined using Cell Titer-Glo Assay. Each experimental condition is performed in triplicate.

• Modèles animaux

  8-week-old female BNX mice bearing KMS11 cells

• Dosages

  10, 30, or 60 mg/kg

• Administration

  Gavage