AM1241

La liaison aux récepteurs cannabinoïdes est testée en utilisant la liaison par compétition-équilibre vs [³H]CP55,940. AM-1241 est dilué dans 25 mM Tris base (pH 7,4)/5 mM MgCl₂/1 mM EDTA/0,1% BSA essentiellement sans acide gras et transféré dans des plaques à 96 puits traitées au Regisil. [³H]CP55,940 (DuPont_NEN ; activité spécifique 100–180 Ci/mmol ; 1 Ci =37 GBq) est ajouté à une concentration de 0,8 nM. Des membranes préparées à partir de cerveau de rat (contenant des récepteurs CB1) ou de rate de souris (contenant des récepteurs CB2) sont ajoutées (≈50 μg de protéines membranaires par puits), les plaques sont incubées à 30 °C pendant 1 heure, et le contenu est filtré sur des filtres Packard Unifilter GF/B à 96 puits à l'aide d'un moissonneur de cellules Packard Filtermate 196. Les filtres sont lavés avec 50 mM Tris base/5 mM MgCl₂/0,5% BSA glacés et séchés. La radioactivité liée est quantifiée et corrigée pour la liaison non spécifique, et les résultats sont normalisés entre 0% et 100% de [³H]CP-55,940 spécifiquement lié. L'IC50 est déterminée par analyse de régression non linéaire à l'aide de GraphPad PRISM et transformée en valeur Ki. Toutes les données sont recueillies en double. Les valeurs IC50 et Ki sont déterminées à partir de trois expériences indépendantes.

HEK cells and CHO cell lines stably express human CB2 receptor and CB1 receptor.

12 concentrations between 0.1 nM–10 μM

90 minutes

Membrane samples are prepared from HEK cells stably expressing the human CB2 receptors previously generated (Mukherjee et al., 2004), or the CHO cell line that stably expresses the human CB1 receptor. Radioligand binding assays are performed as following. Briefly, the cells are harvested and homogenized using a Polytron for 2 × 10 s bursts in a buffer containing 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM MgCl₂, and 1mM EDTA in the presence of protease inhibitors followed by centrifugation at 45 000 g for 20 minutes. The membrane pellets are washed and frozen at -80 °C in aliquots until use. Saturation binding reactions are performed at 30 °C for 90 minutes using [³H]CP 55,940 (0.01–8 nM) in an assay buffer containing 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2.5 mM EDTA, 5mM MgCl₂, and 0.05% fatty acid free bovine serum albumin (BSA) and the reactions are terminated by rapid vacuum filtration through UniFilter-96 GF/C filter plates and four washes with cold assay buffer. Competition experiments are conducted using 0.5 nM [³H]CP 55,940 in the presence of test compounds (0.1 nM–10 μM). Nonspecific binding is defined by 10 mM unlabeled CP 55,940. K_D values from saturation binding assays and Ki values from competition binding assays are determined with one site binding or one site competition curve fitting using the Prism software.

250-350 g male Sprague-Dawley rats

0, 100, 300, 1000, 3000 μg/kg

Administered via i.p.