PNU-120596 AChR Modulator

PNU-120596 increases agonist (Ach)-evoked calcium flux mediated by an engineered variant of the human α7 nAChR. This compound increases agonists (choline and ACh)-evoked currents mediated by wild-type receptors and also demonstrates a pronounced prolongation of the evoked response in the continued presence of agonist in Xenopus oocytes. It increases the channel mean open time ofα7 nAChRs but has no effect on ion selectivity and relatively little, if any, effect on unitary conductance. When applied to acute hippocampal slices, this chemical increases the frequency of ACh-evoked GABAergic postsynaptic currents measured in pyramidal neurons; this effect is suppressed by TTX, suggesting that it modulates the function of α7 nAChRs located on the somatodendritic membrane of hippocampal interneurons. [1] Besides the positive modulation to α7 nAChR, this compound induces a profound retardation of the kinetics of desensitization, raising the potential of Ca²⁺-induced toxicity through excessive stimulation of α7 nAChR. [2] It causes changes in cysteine accessibility at the inner beta sheet, transition zone and agonist binding site while binding to α7 nAChR. Binding sites for this chemical are not in the agonist-binding sites and it enhances agonist-evoked gating of nicotinic receptors by eliciting conformational effects that are similar but nonidentical to the gating conformations promoted by Ach. [3]

Ca²⁺ Fluorescentie Assay

SH-EP1 humane epitheelcellen die een variant van de α7 nAChR (α7^*) tot expressie brengen, worden gekweekt in minimaal essentieel medium (MEM) dat niet-essentiële aminozuren bevat, aangevuld met 10% foetaal runderserum, L-glutamine, 100 U/ml penicilline/streptomycine, 250 ng/ml fungizon, 400 μg/ml hygromycine B en 800 μg/ml geneticine. α7^* is een variant van de menselijke α7 nAChR, met twee puntmutaties in het eerste transmembraandomein (T230P en C241S) die een hoge functionele expressie in SH-EP1-cellen mogelijk maken [Groppi VE, Wolfe ML, Berkenpas MB (2003) U.S. Patent 6,693,172 B1]. Cellen worden gekweekt in een incubator van 37 °C met 6% CO₂. Cellen worden getrypsiniseerd en geplaatst in 96-well platen met donkere zijwanden en heldere bodems met een dichtheid van 2 × 10⁴ cellen/well 2 dagen voor analyse. Cellen worden geladen met een mengsel van Calcium reen-1AM in watervrije dimethylsulfoxide en 20% pluronic F-127. Dit reagens wordt rechtstreeks aan het groeimedium van elke well toegevoegd om een uiteindelijke concentratie van 2 μM Calcium Green-1 AM te bereiken. Cellen worden vervolgens 1 uur geïncubeerd in de kleurstof bij 37 °C en daarna vier keer gewassen met Mark's gemodificeerde Earle's gebalanceerde zoutoplossing (MMEBSS), bestaande uit het volgende (in mM): 4 CaCl₂, 0.8 MgSO₄, 20 NaCl, 5.3 KCl, 5.6 D-glucose, 20 Tris-HEPES, en 120 N-methyl-D-glucamine, pH 7.4. Na de vierde cyclus mogen de cellen minimaal 10 minuten incuberen bij 37 °C. Het uiteindelijke volume MMEBSS in elke well is 100 μL en atropine wordt aan alle wells toegevoegd voor een uiteindelijke concentratie van 1 μM. Een fluorometrische imaging plate reader (FLIPR; Molecular Devices, Union City, CA) is ingesteld om Calcium Green te exciteren bij 488 nm met 500 mW vermogen en fluorescentie-emissie van >525 nm te meten. Een belichting van 0,5 seconden wordt gebruikt om elke well te belichten. Fluorescentie wordt gedetecteerd met een F-stop ingesteld op 2.0 of 1.2. Na 30 seconden basislijnregistratie worden testverbindingen aan elke well van een 96-well plaat toegevoegd in 50 μL van een 3 × stock. In elk experiment worden vier wells gebruikt als vehikel (0,2% DMSO) controles.

Systemic administration of PNU-120596 (1 mg/kg) to rats improves the auditory gating deficit caused by amphetamine, a model proposed to reflect a circuit level disturbance associated with schizophrenia. [1] When administered prior to Carrageenan, 30 mg/kg of this compound significantly blunts mechanical hyperalgesia and weight bearing deficits for up to 4 hours. This chemical attenuates the carrageenan-induced increase in levels of TNF-α and IL-6 within the hindpaw oedema, diclofenac only attenuated IL-6 levels. Established mechanical hyperalgesia induced by Carrageenan or CFA is also partially reversed by this agent. [4]