PHA-793887 CDK Remmer

Multi-CDK inhibitor.

PHA-793887 heeft een lage activiteit tegen CDK1, CDK4, CDK9 en GSK3β met een IC50 van respectievelijk 60 nM, 62 nM, 138 nM en 79 nM. Deze verbinding remt de celproliferatie van vele tumorcellijnen, waaronder A2780, HCT-116, COLO-205, C-433, DU-145, A375, PC3, MCF-7 en BX-PC3, met een IC50 van 88 nM–3,4 μM. Het (1 μM) vertoont een afname in de S-fase, een daaropvolgende toename van de G1-fase en een lichte accumulatie van de G2/M-fase in A2780-cellen. Deze chemische stof (3 μM) verhoogt de G2/M-fase aanzienlijk en vermindert de DNA-synthese. [1] Het is cytotoxisch voor leukemiecellijnen, waaronder K562, KU812, KCL22 en TOM1, met een IC50 van 0,3–7 μM, maar het is niet cytotoxisch voor normale ongestimuleerde perifere bloedmononucleaire cellen of CD34+ hematopoëtische stamcellen. In kolonie-assays vertoont deze verbinding een zeer hoge activiteit tegen leukemiecellijnen met een IC50 van minder dan 0,1 μM. Het induceert Cell Cycle-arrest, remt Rb- en nucleofosmine-fosforylering, moduleert de expressie van cycline E en cdc6 bij 0,2−1 μM en induceert Apoptosis related bij 5 μM. [2]

CDK-kinase-assay

De biochemische activiteit van verbindingen wordt bepaald door incubatie met specifieke enzymen en substraten, gevolgd door kwantificering van het gefosforyleerde product. PHA-793887 (1,5 nM–10 μM) wordt gedurende 30-90 min bij kamertemperatuur geïncubeerd in aanwezigheid van een ATP/³³P-γ-ATP-mengsel, substraat en het specifieke enzym (0,7-100 nM) in een eindvolume van 30 μL kinasebuffer, gebruikmakend van 96-wells U-bodemplaten. Na incubatie wordt de reactie gestopt en wordt het gefosforyleerde substraat gescheiden van niet-geïncorporeerd radioactief ATP met behulp van SPA-bolletjes, Dowex-hars of een Multiscreen fosfocellulosefilter als volgt: (1) Voor SPA-assays. De reactie wordt gestopt door toevoeging van 100 μL PBS + 32 mM EDTA + 0,1% Triton X-100 + 500 μM ATP, bevattende 1 mg streptavidine-gecoate SPA-bolletjes. Na 20 min incubatie voor substraatvangst wordt 100 μL van het reactiemengsel overgebracht naar Optiplate 96-wells platen die 100 μL 5 M CsCl bevatten, 4 uur laten staan om stratificatie van de bolletjes naar de bovenkant van de plaat mogelijk te maken, en geteld met behulp van TopCount om het in het substraat geïncorporeerde fosfaat te meten. (2) Voor Dowex-harsassay. Een hoeveelheid van 150 μL hars/formiaat, pH 3,00, wordt toegevoegd om de reactie te stoppen en niet-gereageerd ³³P-γ-ATP te vangen, waardoor het wordt gescheiden van het gefosforyleerde substraat in oplossing. Na 60 min rust wordt 50 μL supernatant overgebracht naar Optiplate 96-wells platen. Na toevoeging van 150 μL Microscint 40 wordt de radioactiviteit geteld in de TopCount. (3) Voor Multiscreen-assay. De reactie wordt gestopt met de toevoeging van 10 μL EDTA (150 mM). Een hoeveelheid van 100 μL wordt overgebracht naar een MultiScreen-plaat om substraatbinding aan het fosfocellulosefilter mogelijk te maken. De platen worden vervolgens drie keer gewassen met 100 μL H₂PO₄ (75 mM) gefilterd door een MultiScreen-filtratiesysteem, en gedroogd. Na toevoeging van 100 μL Microscint 0 wordt de radioactiviteit geteld in de TopCount. IC50-waarden worden verkregen door niet-lineaire regressieanalyse.

PHA-793887 (10–30 mg/kg) vertoont een goede werkzaamheid in humane ovariumcarcinoom A2780, coloncarcinoom HCT-116 en pancreascarcinoom BX-PC3 xenograft-modellen. [1] Deze verbinding (20 mg/kg) is effectief in xenograft-modellen van K562- en HL60-cellen, een primair leukemisch gedissemineerd model en een gedissemineerd ALL-2-model met een hoge ziektelast, afgeleid van een patiënt met een recidiverende Philadelphia-positieve acute lymfoïde leukemie. [2]