Zotarolimus (ABT-578)

Zotarolimus (ABT-578) is een semi-synthetisch analoog van rapamycine, gemaakt door een tetrazoolring te substitueren voor de oorspronkelijke hydroxylgroep op positie 42 in rapamycine. Deze verbinding is zeer effectief in het remmen van zowel de proliferatie van gladde spiercellen als endotheelcellen, met IC50-waarden van respectievelijk 2,9 nM en 2,6 nM. [1] Het is mechanistisch vergelijkbaar met sirolimus door een hoge-affiniteitsbinding aan het immunofiline FKBP12 en een vergelijkbare potentie voor het remmen van in vitro proliferatie van zowel menselijke als ratten-T-cellen. Zotarolimus remt Con A-geïnduceerde proliferatie van menselijke T-cellen en ratten-T-cellen met een IC50 van respectievelijk 7,0 nM en 1337 nM. [2]

Zotarolimus (ABT-578) vermindert effectief neointimaformatie in een 28-dagen, goed gekarakteriseerd varkensmodel van coronaire arteriestenose. Het lijkt effectief in het voorkomen van neointimale verdikking, waardoor laat verlies wordt verminderd van 1,03 naar 0,62 mm met een reductie van 47% in TVF vergeleken met 'bare metal stents' (15,4% met de Driver-stent tot 8,1% met de Endeavor-stent). [1] Deze verbinding is werkzaam in het onderdrukken van adjuvante DTH, EAE en cardiale allograftafstoting met ED50-waarden van respectievelijk 1,72, 1,17 en 3,71 mg/kg/dag. [2]

• Bindingsaffiniteit voor FKBP12

  96-well microtiterplaten worden eerst gecoat met FKBP-12 CMP-KDO synthetase fusie-eiwit bij 10 μg/mL, 100 μL/well gedurende 2-3 uur, gevolgd door toevoeging van 50 μL/well buffer A (2% BSA en 0,2% Tween-20 in D-PBS) gedurende 30-60 min. Microtiterplaten worden vervolgens driemaal gewassen met buffer B (0,2% Tween in D-PBS, pH aangepast tot 7,4). Vijftig microliter buffer A (voor maximum), 20 μM FK506 in buffer A (voor achtergrond), of verschillende concentraties Zotarolimus (ABT-578) (10 pM-1 μM) in buffer A worden aan elke put toegevoegd, gevolgd door toevoeging van 50 μL A-79397 (een FK506-analoog)-alkalinefosfataseconjugaat in buffer A. Microtiterplaten worden 2-2,5 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd, gevolgd door drie wasbeurten met buffer B. Ongeveer 100 μL pNPP (p-nitrofenylfosfaat) in 0,1 M aminomethylpropanol worden aan elke put toegevoegd en platen worden 90-120 min bij kamertemperatuur geïncubeerd. Absorbantie bij 405 nM wordt afgelezen met een ELISA-plaat

• Cellijnen

  Human coronary artery cells

• Concentraties

  ~1 μM

• Incubatietijd

  5 days

• Methode

  Cell proliferation is assayed by measuring tritiated thymidine incorporation in vitro. Human coronary artery cells (hCa) are seeded into tissue culture flasks for expansion and applied to 96-well plates at desired density in complete media (5000 hCaSMC; 10 000 hCaEC). After 2 days, complete media is replaced with incomplete media to synchronize cells and induce G0 state. Two days later, incomplete media are removed and replaced with complete media (serum/growth factors) to induce G0 to G1 transition. Complete media also contain Zotarolimus (ABT-578) at desired concentrations to determine its effects on cell proliferation. On day 7, ³H-thymidine is added to cells to monitor DNA synthesis, and cells are harvested after overnight incorporation of radioactivity. After an incubation period of 72 h, 25 μL (1 μCi/well) of ³H-thymidine are added to each well. The cells are incubated at 37°C for 16-18 h to allow for incorporation of ³H-thymidine into newly synthesized DNA and the cells harvested onto 96-well plates containing bonded glass fibre filters . The filter plates are air-dried overnight, MicroScint-20 (25 μL) added to each filter well and counted. Drug activity is determined by the inhibition of ³H-thymidine incorporation into newly synthesized DNA relative to cells grown in complete media.

• Dierlijke modellen

  Male Sprague-Dawley rats

• Doseringen

  2.5 mg/kg

• Toediening

  intravenous or oral