Wortmannin (SL-2052)

De remming van MLCK door Wortmannin wordt niet beïnvloed door calmoduline of peptidesubstraat, terwijl het wordt verminderd door een hoge ATP-concentratie. Deze verbinding interageert direct met het katalytische domein van MLCK en leidt tot een onomkeerbaar verlies van de enzymactiviteit. Het heeft geen remmende werking op cAMP-afhankelijke proteïnekinase, cGMP-afhankelijke proteïnekinase en calmoduline-afhankelijke proteïnekinase II, en heeft weinig effect op de proteïnekinase C-activiteit. [1]

Deze remmer remt N-formylmethionyl-leucylfenylalanine (fMLP)-gestimuleerde PtdInsP3 (fosfatidylinositol 3,4,5-trifosfaat) vorming met een IC50 van 5 nM en deze remming wordt volledig opgeheven wanneer voorbehandeld met 100 nM van deze verbinding in menselijke neutrofielen, met verhoogde PtdInsP2-niveaus en geen effecten op cellulaire PtdInsP- en PtdIns-gehaltes. Het zou oscillerende veranderingen in F-actinegehalte kunnen ontwikkelen en remt fMLP-gestimuleerde actinepolymerisatie in neutrofielen niet. [2]

Deze chemische stof remt onomkeerbaar de fosfatidylinositol 3-kinase (PI3-kinase) activiteit door binding aan het 110-kDa eiwit (IC50 van 3 nM) en heeft geen effect op PI4-kinase in RBL-2H3 cellen. Het remt ook de leukotrieenafgifte, zonder effect op de activering van de tyrosinekinase Lyn. [3]

Deze verbinding heft de geïnduceerde hexose-opname in geïsoleerde ratadipocyten volledig op bij 0,1 μM, zonder de gestimuleerde lipolytische activiteit te belemmeren. [4]

Het onderdrukt de geïnduceerde productie van stikstofmonoxide met 50% bij 500 nM in menselijke navelstrengendotheelcellen, wat een reactie is op IGF-1. [5]

Deze chemische stof onderdrukt DNA-dubbelstrengsbreuk (DSB)-herstel en heeft geen effect op DSB-niveaus of de kinetiek van enkelstrengsbreuk (SSB)-herstel in Chinese hamsterovariumcellen bij 50 μM. Het zou de door ioniserende straling (IR) geïnduceerde cytotoxiciteit kunnen potentiëren zonder zelf toxiciteit te vertonen. [6]

Deze remmer remt de polo-like kinase (PLK1) activiteit met een IC50 van 24 nM in intacte G2/M-gearresteerde cellen. [7]

Het verhoogt de Toll-like receptor (TLR)-gemedieerde accumulatie van IL-6 in menselijke macrofagen met een EC50 van 50 nM. Ondertussen verhoogt deze verbinding significant de TLR-gemedieerde induceerbare stikstofoxidesynthase (iNOS)-expressie en nitrietaccumulatie in muizenmacrofagen. Het activeert de nucleaire factor-κB en reguleert de cytokine-mRNA-productie omhoog. [8]

Deze chemische stof remt ook Polo-like kinase (PlK) 1 en PlK3, die belangrijke rollen spelen in de mitose. De behandeling ervan zou kunnen leiden tot een vermindering van de fosforylering van p53 op serine 20 geïnduceerd door DNA-schade. [9]

Het onderdrukt hyaluronan-geïnduceerde Akt-fosforylering en celmotiliteit/-migratie in SW1990-cellen. [10]

Wortmannin remt peritoneale metastase van SW1990 in muizen bij 1 mg/kg, zonder enig gewichtsverlies. [10]

Deze verbinding remt fosfatidylinositide 3-kinase-proteïnekinase B (PKB)/Akt-fosforylering in zowel normale weefsels (long-, hart- en hersenhomogenaten) als tumorweefsel in muizen, zonder mortaliteit of acute toxiciteit bij 0,7 mg/kg. In combinatie met LY188011 verhoogt deze chemische stof significant de apoptose en remt het de tumorgroei in orthotopische tumoren, terwijl beide monotherapieën dat niet konden. [11]

• MLCK-test

  MLCK-activiteit wordt bepaald met peptidesubstraat (KKRPQRATSNVFS-NH₂) of myosine lichte keten. Het peptidesubstraat (24 μM) wordt gefosforyleerd in een reactiemengsel dat 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 mg/mL bovien serumalbumine, 4 mM MgCl₂, 0,5 mM CaCl₂, 2,6 nM calmoduline, 1,5 nM MLCK en 400 μM ATP bevat in een eindvolume van 0,25 mL. Na een pre-incubatie van 10 minuten bij 28 °C zonder ATP, wordt de reactie gestart door toevoeging van ATP bij 28 °C en beëindigd door toevoeging van 0,1 mL 10% (v/v) azijnzuur na 30 minuten. Het mengsel wordt geanalyseerd door hogedrukvloeistofchromatografie: kolom, Unisil Pack 5C18 4,6 X 150 mm; oplosmiddel, 18% (v/v) acetonitril, 0,1% (v/v) trifluorazijnzuur in water; stroomsnelheid, 1,0 mL/min; temperatuur, 40 °C; detectie, absorptie bij 220 nm. Het percentage reactie wordt berekend uit de verhouding van piekgebieden van de gefosforyleerde vorm tot die van de niet-gefosforyleerde vorm. De specifieke activiteit gemeten onder de hierboven beschreven omstandigheden is 0,81 μmol/min/mg. Myosine lichte keten (108 μg/mL) wordt gefosforyleerd in een reactiemengsel dat 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 mg/mL bovien serumalbumine, 4 mM MgCl₂, 0,5 mM CaCl₂, 4,2 nM calmoduline, 0,92 nM enzym en 10 μM[γ-³²P]ATP (100-900 cpm/pmol) bevat in een eindvolume van 0,25 mL. Na een pre-incubatie van 3 minuten bij 30 °C zonder ATP, wordt de reactie gestart door toevoeging van [γ-32P]ATP bij 30 °C en gestopt door toevoeging van 0,125 mL trichloorazijnzuur na 5 minuten. De zuur-precipiteerbare materialen worden verzameld op een nitrocellulosemembraanfilter en gewassen met vier aliquots van 1 mL 5% (v/v) trichloorazijnzuur. De radioactiviteit op de filter wordt gemeten in een tolueenscintillatievloeistof, met behulp van een Packard Tri-Carb vloeistofscintillatiespectrometer Model 4530. De specifieke activiteit gemeten onder de omstandigheden is 1,23 μmol/min/mg. [1]

• Cellijnen

  NK cells

• Concentraties

  1 μM

• Incubatietijd

  1 h

• Methode

  Primary NK cells were pretreated with wortmannin (1 μM) for 1 h, washed twice with RPMI 1640, and then treated with IL-15 (10 ng/mL) for 24 h. DMSO was used as control.

• Dierlijke modellen

  Human pancreatic adenocarcinoma cells PK1 are injected both s.c. and orthotopically into SCID mice.

• Doseringen

  0.175, 0.35, and 0.7 mg/kg

• Toediening

  Injected by i.v.