Volasertib (BI6727)

Net als BI2536 is BI6727 een ATP-competitieve kinaseremmer uit de dihydropteridinone-klasse van verbindingen. Naast Plk1 remt deze verbinding ook krachtig twee nauw verwante kinasen Plk2 en Plk3 met een IC50 van respectievelijk 5 nM en 56 nM. Deze chemische stof vertoont bij concentraties tot 10 μM geen remmende activiteit tegen een panel van >50 andere kinasen. Het remt de proliferatie van meerdere cellijnen afkomstig van verschillende kankerweefsels, waaronder HCT116, NCI-H460, BRO, GRANTA-519, HL-60, THP-1 en Raji-cellen met een EC50 van respectievelijk 23 nM, 21 nM, 11 nM, 15 nM, 32 nM, 36 nM en 37 nM. Deze behandeling met de verbinding (100 nM) in NCI-H460-cellen induceert een accumulatie van mitotische cellen met monopolaire spoelen en een positieve kleuring voor histone H3 fosfoserine 10, wat bevestigt dat cellen vroeg in de M-fase worden gearresteerd, gevolgd door inductie van apoptose. [1] Lage nanomolaire concentraties van deze remmer vertonen een krachtige remmende activiteit tegen neuroblastoom (NB) tumor-initiërende cellen (NB TIC) met een EC50 van 21 nM, terwijl slechts micromolaire concentraties ervan cytotoxisch zijn voor normale pediatrische neurale stamcellen. [2] Het induceert groeiremming van Daoy- en ONS-76-medulloblastoomcellen, vergelijkbaar met BI 2536. [3]

Toediening van BI6727 remt significant de groei van meerdere menselijke carcinoom-xenografts, waaronder HCT116, NCI-H460 en taxaan-resistent CXB1 coloncarcinoom, vergezeld van een toename van de mitotische index en een toename van apoptose. [1] In in vivo studies vertoont deze verbinding een beter toxiciteits- en farmacokinetisch profiel in vergelijking met BI2536. [3]

• In vitro kinase-assays

  Recombinant humaan Plk1 (residuen 1-603) wordt tot expressie gebracht als NH₂-terminaal, GST-gelabeld fusie-eiwit met behulp van een baculoviraal expressiesysteem en gezuiverd door affiniteitschromatografie met glutathion-agarose. Enzymactiviteitsassays voor Plk1 worden uitgevoerd in aanwezigheid van seriek verdunde deze verbinding met 20 ng recombinant kinase en 10 μg caseïne uit koemelk als substraat. Kinase-reacties worden uitgevoerd in een eindvolume van 60 μL gedurende 45 minuten bij 30 °C [15 mM MgCl₂, 25 mM MOPS (pH 7.0), 1 mM DTT, 1% DMSO, 7.5 μM ATP, 0.3 μCi γ-³²P-ATP]. Reacties worden beëindigd door toevoeging van 125 μL ijskoude 5% TCA. Na overbrenging van de precipitaten naar MultiScreen gemengde ester cellulose filterplaten, worden de platen gewassen met 1% TCA en radiometrisch gekwantificeerd. Dosis-respons-curven worden gebruikt voor het berekenen van de IC50-waarde.

• Cellijnen

  HCT116, NCI-H460, BRO, GRANTA-519, HL-60, THP-1, and Raji

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~1 μM

• Incubatietijd

  24, 48, and 72 hours

• Methode

  Cell proliferation assays are done by incubating cells in the presence of various concentrations of this compound for 24, 48, and 72 hours and cell growth is assessed by measuring Alamar blue dye conversion in a fluorescence spectrophotometer. Effective concentrations at which cellular growth is inhibited by 50% (EC50) are extrapolated from the dose-response curve fit. To determine the DNA content, cell suspensions are fixed in 80% ethanol, treated for 5 minutes with 0.25% Triton X-100 in PBS, and incubated with 0.1% RNase and 10 μg/mL propidium iodide in PBS for 20 minutes at room temperature. Cell cycle profiles are determined by flow cytometric analysis.

• Dierlijke modellen

  Female BomTac:NMRI-Foxn1^nu mice grafted s.c. with HCT116, NCI-H460, or CXB1 cells

• Doseringen

  ~25 mg/kg/day

• Toediening

  Injected i.v., or given intragastrally via gavage needle