Ro-3306

RO-3306 remt de CDK1/cycline B1-, CDK1/cycline A-, CDK2/cycline E- en CDK4/cycline D-activiteit met een Ki van respectievelijk 35 nM, 110 nM, 340 nM en meer dan 2000 nM. Behandeling van HCT116-, SW480- en HeLa-cellen met RO-3306 gedurende 20 uur leidt tot een volledige blokkering van de celcyclus in de G2/M-fase. De proliferatie van zowel HCT116 als SW480 wordt effectief geblokkeerd door RO-3306. RO-3306 lijkt meer proapoptotisch te zijn in kankercellen (HCT116 en SW480) dan in niet-tumorogene cellen (MCF 10A en MCF 12A).[1]

RO-3306 stopt effectief de oöcytmaturatie bij een concentratie van 10 μM.[2]

RO-3306 is een ATP-competitieve en selectieve CDK1-remmer.

• CDK-analyse

  De activiteit van CDK1 cycline B1, CDK1 cycline A, CDK2 cycline E en CDK4 cycline D wordt gemeten door een homogene, tijdsopgeloste fluorescentie-analyse in een 96-well formaat. De analysebuffer bevatte 25 mM Hepes, 6,25 mM MgCl2, 0,003% Tween 20, 0,3 mg/mL BSA, 1,5 mM DTT en ATP als volgt: 162 μM (CDK1), 90 mM (CDK2) of 135 μM (CDK4). De CDK1- en CDK2-buffer bevatte 10 mM MgCl2. Testverbindingen worden verdund in analysebuffer tot 3 keer hun uiteindelijke concentratie in 20 μL, en de reactie wordt gestart door de toevoeging van 40 μL analysebuffer die het pRB-substraat (0,185 μM) bevat. De platen worden gedurende 30 min bij 37°C geïncubeerd met constante agitatie, en de reactie wordt beëindigd door de toevoeging van 15 μL 1,6 μM anti-fosfo pRB-antilichaam (Ser-780) in 25 mM Hepes, 24 mM EDTA en 0,2 mg/mL BSA. Na een aanvullende incubatie van 30 min met schudden, wordt 15 μL 3 nM Lance-Eu-W1024-gelabeld anti-konijn IgG en 60 nM Alophycocyanine-geconjugeerd anti-His-6-antilichaam in 25 mM Hepes en 0,5 mg/mL BSA toegevoegd en gedurende 1 uur geïncubeerd. De platen worden afgelezen in de Victor-V multi-label lezer bij excitatie 340 nm en emissie 615 nm en 665 nm. De IC50-waarden worden berekend uit de metingen bij 665 nm en genormaliseerd voor Europium-metingen bij 615 nm. Ki-waarden worden berekend volgens de vergelijking: Ki= IC50/(1 + S/Km ), waarbij S de ATP-concentratie in de analyse is en Km de Michaelis-Menten-constante voor ATP. De remmende activiteit tegenover het panel van kinasen wordt bepaald door de IMAP-analysetechnologie.

• Cellijnen

  MDA-MB-231 cell line

• Concentraties

  20 μM

• Incubatietijd

  72 h

• Methode

  Log phases cells (25,000) are seeed in 96-well plates and incubated in a 37℃ incubator with CO2, After 24 h, different concentrations of RO-3306 are administered to determine the drug concentrations required to achieve a 50% growth inhibition (IC50). MTT (20 μL, 5mg/mL stock solution in saline) is added to each well and the cells are incubated for 4 h. Supernatants are removed and formazan crystals from viable cells are solubilized with 200 μL anhydrous DMSO. The absorbance is detected with a 550 model microplate reader at the 565 nm wavelength.

• Dierlijke modellen

  Female BALB/c mice

• Doseringen

  1.5 mg/kg

• Toediening

  i.n.