PP2 (AGL 1879)

PP2 remt Src door te binden aan een gebied van het molecuul dat niet overlapt met het ATP-bindingsdomein. [2] Deze verbinding (20 μM) induceert 40-50% groeiremming van HT29-cellen, deze concentratie vermindert de Src-activiteit al na 1 uur en handhaaft een 35% remming van de Src-activiteit gedurende 2 dagen. Het (100 mM) vermindert de Src-activiteit van HT29-cellen op een dosisafhankelijke manier. Deze chemische stof (1 mM-100 mM) veroorzaakt een dosisafhankelijke groeiremming van menselijke darmkankercellen (HT29, SW480 en PMCO1), leverkankercellen (PLC/PRF/5, KYN-2, Li7 en HepG2) en borstkankercellen (MCF-7, MDA-MB-468 en BT-474). Het (20 μM) verhoogt significant de aggregatie in de meeste kankercellen (HT29, SW480, PMCO1, PLC/PRF/5, KYN-2, Li7, MCF-7 en MDA-MB-468) op een E-cadherineafhankelijke manier. Deze verbinding (20 μM) verbetert de E-cadherine-expressie en verhoogt ook sterk de associatie van E-cadherine met het actine-cytoskelet in kankercellen. Het (20 μM) verhoogt de expressie van α-catenine, β-catenine en γ-catenine in HT29-cellen, terwijl in PLC/PRF/5- en MCF-7-cellen het totale eiwitniveau van α-catenine niet verandert, maar de niveaus van β-catenine en γ-catenine licht toenemen. [3] Deze remmer remt de proliferatie van twee baarmoederhalskankercellen (HeLa en SiHa) op een tijd- en dosisafhankelijke manier. Het (10 μM) reguleert pSrc-Y416, pEGFR-Y845 en -Y1173 expressieniveaus in HeLa- en SiHa-cellen neerwaarts. Deze chemische stof (10 μM) zou de celcyclusstop kunnen moduleren door p21(Cip1) en p27(Kip1) in zowel HeLa- als SiHa-cellen opwaarts te reguleren en de expressie van cycline A en cycline-afhankelijke kinase-2, -4 (Cdk-2, -4) in HeLa en van cycline B en Cdk-2 in SiHa neerwaarts te reguleren. [4]

PP2 (5 mg/kg/dag) induceert enige vertraging in de groeisnelheid van de primaire tumoren ten opzichte van de controle behandeld met vehiculum in SCID-muizen geïnoculeerd met HT29-cellen in de milt. Deze verbinding induceert enige vertraging in de groeisnelheid van de primaire tumoren ten opzichte van de controle behandeld met vehiculum in SCID-muizen geïnoculeerd met HT29-cellen in de milt. Deze chemische stof vermindert significant het relatieve levergewicht en het volume van levermetastasen in vergelijking met de controles in SCID-muizen geïnoculeerd met HT29-cellen in de milt. [3] Ratten behandeld met deze verbinding (1,5 mg/kg i.p.) vertonen ongeveer 50% reductie van de infarctgrootte op T2-gewogen MRI en in TTC-kleuring vergeleken met controles bij ratten met focale ischemische hersenletsel. Deze chemische stof resulteert in een betere neurologische score dan controles bij ratten met focale ischemische hersenletsel. [5]

• Enzymassays met immuuncomplex

  De zuurbehandelde enolase wordt 1:20 verdund met 1× PBS voordat 100 μL/putje wordt gealiquoteerd in een Nunc 96-well high protein binding assayplaat. De assayputjes worden vervolgens geaspireerd; geblokkeerd met 0,5% runderserum, 1× PBS gedurende 1 uur bij 37 ℃; en vervolgens vijf keer gewassen met 300 μL van 1× PBS/putje. De bron van Lck is ofwel LSTRA-cellen of Lck uitgedrukt in HeLa-cellen met behulp van een vaccinia-expressiesysteem. FynT wordt uitgedrukt in HeLa-cellen met behulp van het vacciniasysteem. Cellen (12,5×10⁶/mL) worden gelyseerd in lysisbuffer, en de lysaten worden geklaard door centrifugatie bij 14.000 cpm gedurende 15 min bij 4 ℃ in een Eppendorf-buis. De geklaarde lysaten worden vervolgens geïncubeerd met de geschikte anti-kinase antilichaam bij 10 μg/mL gedurende 2 uur bij 4 ℃. Proteïne A-Sepharose kralen worden toegevoegd aan het antilichaam/lysaat mengsel bij 250 μL/mL en mogen 30 min incuberen bij 4 ℃. De kralen worden vervolgens tweemaal gewassen in 1 mL lysisbuffer en tweemaal in 1 mL kinasebuffer (25 mM HEPES, 3 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂ en 100 μM natriumorthovanadaat) en opnieuw gesuspendeerd tot 50% (w/v) in kinasebuffer. Vijfentwintig microliter van de kraalsuspensie wordt toegevoegd aan elk putje van de enolase-gecoate 96-well high protein binding plaat samen met een geschikte concentratie van deze verbinding en [γ-³²P]ATP (25 μL/putje van een 200 μCi/mL oplossing in kinasebuffer). Na incubatie gedurende 20 min bij 20 ℃, wordt 60 μL kokende 2× solubilisatiebuffer met 10 mM ATP aan de assayputjes toegevoegd om de reacties te beëindigen. Dertig microliter van de monsters wordt uit de putjes verwijderd, 5 min gekookt en geladen op een 7,5% SDS-polyacrylamidegel. De gels worden vervolgens gedroogd en blootgesteld aan Kodak X-AR film. Voor kwantificering worden films gescand met behulp van een Molecular Dynamics laserscanner, en de optische dichtheid van de belangrijkste substraatband, enolase p46, wordt bepaald. In begeleidende experimenten voor het meten van de activiteit van deze chemische stof tegen Lck, wordt de assayplaat gewassen met twee wascycli op een Skatron harvester met behulp van 50 mM EDTA, 1 mM ATP. Scintillatievloeistof (100 μL) wordt vervolgens aan de putjes toegevoegd, en ³²P-incorporatie wordt gemeten met behulp van een micro-β-teller.

• Cellijnen

  HT29, SW480, PMCO1, PLC/PRF/5, KYN-2, Li7, HepG2, MCF-7, MDA-MB-468 and BT-474 cell lines

• Concentraties

  ~100 μM

• Incubatietijd

  2 days

• Methode

  Cell viability is determined using an in vitro toxicology assay kit following the manufacturer’s instructions. Cells are seeded in 96-well plates at day 0. Starting at day 1, cells are treated for 2 days with each of a series of increasing concentrations of PP2 (1 μM, 10 μM, and 100 μM). At the end of this period, cell proliferation is evaluated  by mitochondria dehydrogenase in viable cells, leading to formazan formation. This experiment is repeated three times with 10 determinations/tested concentration.

• Dierlijke modellen

  SCID mice inoculated HT29 cells in the spleen

• Doseringen

  5 mg/kg/day

• Toediening

  intraperitoneal injection