PHA-767491 HCl

PHA-767491 vertoont ongeveer 20-voudige selectiviteit voor Cdk1, Cdk2 en GSK3-β, 50-voudige selectiviteit voor MK2 en Cdk5 en 100-voudige selectiviteit voor PLK1 en CHK2. PHA-767491 remt celproliferatie in verschillende menselijke cellijnen met een IC50 van 0,86 μM voor SF-268 tot 5,87 μM voor K562, en induceert significant apoptose op een p53-onafhankelijke manier in bijna alle cellijnen in tegenstelling tot 5-FU, dat slechts in enkele cellijnen werkt. In tegenstelling tot huidige DNA-syntheseremmers blokkeert PHA-767491-behandeling bij 5 μM de initiatie van DNA-replicatie, maar niet de voortgang van de replicatievork, als gevolg van specifieke remming van Cdc7-kinase en Mcm2-fosforylatie op de Cdc7-afhankelijke Ser40-plaats. [1] De verhoogde Mcl-1-niveaus in ABT-737-resistente OCI-LY1- en SU-DHL-4-cellen kunnen significant worden verlaagd door PHA-767491-behandeling bij 3 μM, mogelijk als gevolg van de remming van Cdk9, wat leidt tot het herstel van de gevoeligheid voor ABT-737. [2] Het directe mitochondriale afhankelijke pro-apoptotische effect van PHA-767491 wordt ook waargenomen wanneer het wordt toegepast bij 1 μM in quiescente chronische lymfocytische leukemie (CLL) cellen via een vergelijkbaar mechanisme met een EC50 van 0,34-0,97 μM. Terwijl in prolifererende CLL-cellen gestimuleerd door CD154 en interleukine-4, PHA-767491-behandeling bij 5 μM de DNA-synthese afschaft door Cdc7 te remmen in plaats van celdood te veroorzaken. [3]

Toediening van PHA-767491 tweemaal per dag gedurende 5 dagen remt significant de groei van HL60-xenograft op een dosisafhankelijke manier met een TGI van 50% en 92% bij een dosis van respectievelijk 20 mg/kg en 30 mg/kg, waarvan het effect ook duidelijk is in A2780-, Mx-1- en HCT-116-xenograftmodellen, evenals in mamma-carcinomen, en correleert met Cdc7-remming en de daaropvolgende verminderde fosforylatie van Mcm2 op de Cdc7-afhankelijke Ser40-plaats [1]

• In vitro kinase-assays

  De remming van Cdc7 en Cdk9 door PHA-767491 (IC50) wordt bepaald met behulp van de op sterk anionenwisselaar (Dowex 1-X8 hars, formaatvorm) gebaseerde assay. Voor elk enzym worden de absolute K_m-waarden voor ATP en het specifieke substraat initieel bepaald, en elke assay wordt vervolgens uitgevoerd bij geoptimaliseerde ATP/³³P-γ-ATP-mix (2K_m) en substraat (5K_m) concentraties. De Cdc7-kinase-assay wordt uitgevoerd in een buffer die 50 mM Hepes pH 7.9, 15 mM MgCl₂, 2 mM β-glycerylfosfaat, 0.2 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, 2K_m ATP/³³P-γ-ATP-mix, 5K_m Mcm2 (aa 10-294), 37 nM recombinant Cdc7/Dbf4 en toenemende concentratie PHA-767491 bevat in een eindvolume van 30 μL, en geïncubeerd gedurende 1 uur bij 25 °C. De Cdk9-kinase-assay wordt uitgevoerd met 50 nM recombinant Cdk9/cyclin T in 50 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, 2K_m ATP/³³P-γ-ATP-mix, 5K_m RNA-polymerase CDT-peptide en toenemende concentratie PHA-767491 in een eindvolume van 30 μL, en geïncubeerd gedurende 1 uur bij 25 °C. Na incubatie wordt 150 μL hars/formaat (pH 3.0) toegevoegd om de reactie te stoppen en niet-gereageerd ³³P-γ-ATP af te vangen, waardoor het wordt gescheiden van het gefosforyleerde substraat in oplossing. Na 1 uur rust wordt 50 μL supernatant overgebracht naar Optiplate 96-well platen. Na toevoeging van 150 μL Microscint 40 wordt de radioactiviteit geteld in de TopCount.

• Cellijnen

  HeLa, MCF7, HCT-116, U2OS, A2780, K562, SF-539, SF-268, Ovcar8, SW480, COLO205, HCT-15, Jurkat, PC3, and NHDF

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~ 20 μM

• Incubatietijd

  24 or 72 hours

• Methode

  Cells are exposed to PHA-767491 for 24 or 72 hours. Cells are lysed and the ATP content in the well, used as a measure of viable cells, is determined using a thermostable firefly luciferase–based assay. Activation of caspase-3 and caspase-7 is measured as a ratio between treated sample and untreated control with a luciferase-based assay, containing a specific proluminescent substrate. DNA replication is measured as incorporation of nucleotide analog BrdU into DNA by flow cytometry.

• Dierlijke modellen

  Female SCID mice subcutaneously implanted with HL60 cells, male Hsd, athymic nu-nu mice subcutaneously implanted with HCT116 cells, A2780 or Mx-1 cells, and female Sprague-Dawley rats with mammary carcinomas

• Doseringen

  ~50 mg/kg

• Toediening

  Intravenous or oral administration twice a day