Necrostatin-1 (Nec-1)

Necrostatin-1 (1-100 μM) remt de autofosforylering van overgeëxpresseerd en endogeen RIP1. Er is vastgesteld dat RIP1 het primaire cellulaire doelwit is dat verantwoordelijk is voor de antinecroptose-activiteit van deze verbinding. [1]

Deze chemische stof onderdrukt efficiënt necroptotische celdood, veroorzaakt door een reeks stimuli in verschillende celtypen. Het, eerder geïdentificeerd als een kleinmoleculige remmer van necroptose, remt RIP kinase-geïnduceerde necroptose en remt TNF-α-geïnduceerde necroptose in Jurkat-cellen met een EC50 van 490 nM. [2]

Necrostatin-1 (Nec-1) is een specifieke kleine moleculaire remmer van receptor-interacterend proteïnekinase 1 (RIPK1) die specifiek de fosforylering van deze verbinding remt.

• RIP1-kinase-assay

  Fosforylering van RIP1 vereist de kinase-activiteit ervan. Expressieconstructies van FLAG-getagd wildtype (WT) of een kinase-inactieve puntmutant van RIP1 (K45M) worden getransfecteerd in 293T-cellen en de RIP1 kinase-assay wordt uitgevoerd zoals beschreven in de methoden in aanwezigheid van [γ-³²P]ATP gedurende 30 min bij 30℃. Monsters worden onderworpen aan SDS-PAGE en de RIP1-band wordt gevisualiseerd door autoradiografie. Relatieve intensiteiten van radioactieve banden worden gekwantificeerd en worden (verhouding) getoond in deze en alle andere autoradiografieën. Parallel aan kinase-reacties wordt een monster van kralen onderworpen aan western blot-analyse met anti-RIP1-antilichaam om gelijke eiwithoeveelheden in kinase-reacties te garanderen.

• Cellijnen

  Jurkat, BALB/c 3T3, SV40-transformed MEF, L929

• Concentraties

  0.01-100 μM

• Incubatietijd

  --

• Methode

  Cells are seeded in 96-well plates (white plates for luminescent assays; black plates for fluorescent assays; clear plates for MTT assay) at the density of 5,000-10,000 cells per well for adherent cells or 20,000-50,000 cells per well for suspension cells in 100 μl of the appropriate phenol red-free media. After incubation, we determined cell viability using one of the following methods. For the ATP assay, we used luminescence-based commercial kits and analyzed luminescence using a Wallac Victor II plate reader. For Sytox assay, we incubated cells with 1 μM Sytox Green reagent for 30 min at 37℃, and then performed fluorescent reading. Subsequently, we added 5 μl of 20% Triton X-100 solution into each well to produce maximal lysis and incubated cells for 1 h at 37℃, then performed the second reading. We calculated the ratio of values before and after Triton treatment and normalized it to the relevant controls not subjected to cytotoxic stimuli, as indicated in figure legends. For the MTT assay, we used the CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit. For PI exclusion assays, we added 2 μg/ml PI into the medium and immediately analyzed samples using FACSCalibur. For PI-annexin V assay we used the ApoAlert Annexin V-EGFP Apoptosis Kit. For DioC6 staining, we incubated cells with 40 nM DiOC₆ for 30 min at 37 ℃, washed once and analyzed in FACSCalibur. For ROS analysis, we incubated cells with 5 μM dihydroethidium for 30 min at 37 ℃, washed once and analyzed in FACSCalibur. EM analyses are performed at the Harvard Medical School EM facility. We acquired bright-field images of the cells using an Axiovert 200 microscope.

• Dierlijke modellen

  Male C57BL/6 mice

• Doseringen

  0.0468 mg/Kg

• Toediening

  i.a.