Mirin

Mirin remt de DSB-geïnduceerde ATM-activering, de ATM-afhankelijke fosforylering van de stroomafwaartse doelwitten Nbs1 en Chk2 en de MRN-afhankelijke autofosforylering van ATM bij Ser1981 als reactie op DSB's. Deze verbinding remt ook het G2-checkpoint in TOSA4-cellen, en homologie-afhankelijke DNA-reparatie in HEK293-cellen. [1]

In cellen met geïntegreerd HPV16 (SiHa) maakt het HPV-episomen gevoeliger voor PA25, wat resulteert in een ~5-voudige verlaging van de PA25 IC50. [2]

Voorbehandeling met deze chemische stof vermindert ook de cellevensvatbaarheid en remt de prolifererende cel nucleair antigen expressie in cisplatine-behandelde menselijke embryonale nier 293-cellen. [3]

Mirin in nanodeeltjes resulteerde in een scherpe belemmering van tumorgroei, geassocieerd met DDR-activering, p53-accumulatie en celdood.

• Nuclease-analyse

  Reacties met oligonucleotide nonhairpin-substraten bevatten 25 mM MOPS (pH 7.0), 60 mM KCl, 0,2% Tween 20, 2 mM DTT, 1 mM of 5 MnCl₂ (of 5 mM MgCl₂, of 5 mM CaCl₂), 0,1 pmol DNA-substraat en 0,3 pmol Mre11 (of een equivalente hoeveelheid Mre11 gecomplexeerd met Rad50) in een volume van 10 μl, en worden gedurende 30 min bij 37°C geïncubeerd. SDS, EDTA en proteinase K worden vervolgens toegevoegd tot eindconcentraties van respectievelijk 0,2%, 5 mM en 0,1 mg/ml, en nog eens 15 min geïncubeerd. 4 μl van elke reactie wordt gemengd met 4 μl formamide-ladingsbuffer en vervolgens geladen op een sequencinggel met 10% acrylamide en 7 M ureum. Na de loop wordt elke gel geanalyseerd met behulp van een fosforbeeldvormingssysteem. Reacties met hairpin-substraten zijn identiek aan die met nonhairpin-substraten, behalve dat 3 pmol van deze verbinding aan de reacties wordt toegevoegd zoals aangegeven, en de reacties 's nachts bij kamertemperatuur worden geïncubeerd. Niet-homologe eindverbindingen bevatten 25 mM MOPS (pH 7.0), 60 mM KCl, 0,2% Tween 20, 2 mM DTT, 4 mM MgCl₂, 2 mM MnCl₂, 0,5 mM ATP, 4 ng plasmide-DNA, 10% polyethyleenglycol, 0,01 pmol menselijke DNA-ligase I en 0,06 pmol van deze chemische stof of 0,1 eenheden E. coli exonuclease III (GIBCO-BRL), in een volume van 10 μl. Na incubatie bij 37°C gedurende 25 min wordt Tween 20 toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5%, en een 2,5 μl aliquot wordt geamplificeerd door PCR met behulp van primers DAR5 en DAR147. PCR-producten worden gekloneerd met behulp van de TA-kloneringskit en gesequenced met behulp van een geautomatiseerde ABI Capillaire Genetische Analysator.

• Cellijnen

  HEK 293 cells

• Concentraties

  100 μM

• Incubatietijd

  24 h

• Methode

  Human embryonic kidney (HEK) 293 cells are maintained in RPMI-1640 supplemented with 5% heat-inactivated fetal bovine serum, penicillin (100 U/mL), and streptomycin (100 mg/mL) in humidified air with 5% CO₂ at 37 °C. Cells are given fresh medium at 48 h intervals. The cells are seeded in 96-well plates in regular growth medium. Cells are pretreated with mirin (100 μM for 1 h before the cisplatin (20 μM) treatment followed by incubation for 8 and 24 h. The MTT assay is performed using the EZ-Cytox cell viability assay kit according to the manufacturer's protocol and MTT reduction is measured at a 450 nm wavelength using a micro-plate reader.