|
Hoe te citeren 1. Voor in-tekst citatie (materialen en methoden): 2. Voor de tabel met belangrijke bronnen: |
||
|
Gratis nummer: (877) 796-6397 -- Alleen VS en Canada -- |
Fax: +1-832-582-8590 Bestellingen: +1-832-582-8158 |
Technische ondersteuning: +1-832-582-8158 Ext:3 Gelieve uw bestelnummer in de e-mail te vermelden. Wij streven ernaar alle e-mailvragen binnen één werkdag te beantwoorden. |
Biologische Beschrijving
| Specificiteit | LYVE1 Antibody [C2N8] detecteert endogene niveaus van totaal LYVE1-eiwit. |
|---|---|
| Achtergrond | LYVE1 (Lymphatic Vessel Endothelial Hyaluronan Receptor 1) is een type I integraal membraanglycoproteïne en CD44-homoloog dat voornamelijk tot expressie komt op lymfatische endotheelcellen, met een N-terminaal Link-module hyaluronan-bindend domein (HABD) dat een diepe, positief geladen groef vormt, gestabiliseerd door drie disulfidebruggen (bijv. Cys84–Cys105) en β4/β5-loopresiduen Arg104 en Lys107, die hyaluronan (HA)-ketens vastgrijpen via een glijdend mechanisme. Dit domein wordt geflankeerd door een zwaar geglycosyleerde steel met N- en O-gekoppelde glycosyleringsplaatsen die de toegankelijkheid van het HABD reguleren, gevolgd door een transmembraanhelix en een korte cytoplasmatische staart die homodimerisatie via disulfidebindingen bij Cys201 en Cys204 mogelijk maakt voor coöperatieve ligandbinding. In zijn rustende monomere toestand maskeren gesialyleerde glycanen het HABD sterisch; echter, inflammatoire stimuli zoals VEGF-C induceren neuraminidase-gemedieerde desialylering, waardoor de bindingsgroef wordt blootgelegd voor niet-reducerende einddocking van geïmmobiliseerde HA-polymeren. Deze HA-ketens rijgen zich serieel door aangrenzende LYVE1-receptoren, elk met een loslaatkracht van ~40 pN, via een watergesmeerde glij-interactie die omkeerbare leukocytenhaptotaxis ondersteunt en dendritische cellen in staat stelt langs het lymfatische oppervlak te rollen met behulp van hun HA-rijke glycocalyx, terwijl oplosbare HA-endocytose door LYVE1 de interstitiële matrix recycleert om vocht homeostase te handhaven zonder signaaltransductie vanwege de korte cytoplasmatische staart. Dit mechanosensitieve adhesiemechanisme ligt ten grondslag aan het verkeer van immuuncellen naar lymfeklieren en lymfangiogenese, evenals de klaring van weefsel-HA; met name is LYVE1 opgereguleerd in tumor-geassocieerde lymfevaten, wat metastase bevordert door de instroom van dendritische cellen en tumorcellen te verbeteren, vooral wanneer het samen tot expressie wordt gebracht met VEGFR3, terwijl een verminderde LYVE1-gemedieerde HA-klaring bijdraagt aan lymfatische disfunctie bij lymfoedeem. |
Gebruiksinformatie
| Toepassing | IHC, IF, FCM | Verdunning |
|
||
|---|---|---|---|---|---|
| Reactiviteit | Mouse | ||||
| Bron | Rat Monoclonal Antibody | MW | |||
| Opslagbuffer | PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 | Opslag (Vanaf de datum van ontvangst) |
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years | ||
| IHC |
Experimental Protocol：
Deparaffinization/Rehydration
1. Deparaffinize/hydrate sections:
2. Incubate sections in three washes of xylene for 5 min each.
3. Incubate sections in two washes of 100% ethanol for 10 min each.
4. Incubate sections in two washes of 95% ethanol for 10 min each.
5. Wash sections two times in dH2O for 5 min each.
6.Antigen retrieval: For Citrate: Heat slides in a microwave submersed in 1X citrate unmasking solution until boiling is initiated; continue with 10 min at a sub-boiling temperature (95°-98°C). Cool slides on bench top for 30 min.
Staining
1. Wash sections in dH2O three times for 5 min each.
2. Incubate sections in 3% hydrogen peroxide for 10 min.
3. Wash sections in dH2O two times for 5 min each.
4. Wash sections in wash buffer for 5 min.
5. Block each section with 100–400 µl of blocking solution for 1 hr at room temperature.
6. Remove blocking solution and add 100–400 µl primary antibody diluent in to each section. Incubate overnight at 4°C.
7. Remove antibody solution and wash sections with wash buffer three times for 5 min each.
8. Cover section with 1–3 drops HRPas needed. Incubate in a humidified chamber for 30 min at room temperature.
9. Wash sections three times with wash buffer for 5 min each.
10. Add DAB Chromogen Concentrate to DAB Diluent and mix well before use.
11. Apply 100–400 µl DAB to each section and monitor closely. 1–10 min generally provides an acceptable staining intensity.
12. Immerse slides in dH2O.
13. If desired, counterstain sections with hematoxylin.
14. Wash sections in dH2O two times for 5 min each.
15. Dehydrate sections: Incubate sections in 95% ethanol two times for 10 sec each; Repeat in 100% ethanol, incubating sections two times for 10 sec each; Repeat in xylene, incubating sections two times for 10 sec each.
16. Mount sections with coverslips and mounting medium.
|
| IF |
Experimental Protocol:
Sample Preparation
1. Adherent Cells: Place a clean, sterile coverslip in a culture dish. Once the cells grow to near confluence as a monolayer, remove the coverslip for further use.
2. Suspension Cells: Seed the cells onto a clean, sterile slide coated with poly-L-lysine.
3. Frozen Sections: Allow the slide to thaw at room temperature. Wash it with pure water or PBS for 2 times, 3 minutes each time.
4. Paraffin Sections: Deparaffinization and rehydration. Wash the slide with pure water or PBS for 3 times, 3 minutes each time. Then perform antigen retrieval.
Fixation
1. Fix the cell coverslips/spots or tissue sections at room temperature using a fixative such as 4% paraformaldehyde (4% PFA) for 10-15 minutes.
2. Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Permeabilization
1.Add a detergent such as 0.1–0.3% Triton X-100 to the sample and incubate at room temperature for 10–20 minutes.
(Note: This step is only required for intracellular antigens. For antigens expressed on the cell membrane, this step is unnecessary.)
Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Blocking
Add blocking solution and incubate at room temperature for at least 1 hour. (Common blocking solutions include: serum from the same source as the secondary antibody, BSA, or goat serum.)
Note: Ensure the sample remains moist during and after the blocking step to prevent drying, which can lead to high background.
Immunofluorescence Staining (Day 1)
1. Remove the blocking solution and add the diluted primary antibody.
2. Incubate the sample in a humidified chamber at 4°C overnight.
Immunofluorescence Staining (Day 2)
1. Remove the primary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
2. Add the diluted fluorescent secondary antibody and incubate in the dark at 4°C for 1–2 hours.
3. Remove the secondary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
4. Add diluted DAPI and incubate at room temperature in the dark for 5–10 minutes.
5. Wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
Mounting
1. Mount the sample with an anti-fade mounting medium.
2. Allow the slide to dry at room temperature overnight in the dark.
3. Store the slide in a slide storage box at 4°C, protected from light.
|
Referenties
|