GSK2606414

Deze verbinding remt PERK-autofosforylering in A459-cellen met een IC50 van <0,3 μM. [1]

GSK2606414 vertoont een hoge orale beschikbaarheid en een lage tot matige bloedklaring bij muizen, ratten en honden. Deze verbinding, oraal toegediend, remt de tumorgroei op een dosisafhankelijke manier bij muizen met pancreas humane BxPC3-tumoren. [1]

• PKR-achtige Endoplasmatisch Reticulum Kinase (PERK) Assay (HTRF-formaat)

  GST-PERK cytoplasmatisch domein wordt aangekocht. 6-His-full-length menselijk eIF2α wordt gezuiverd uit baculovirusexpressie in Sf9-insectencellen. Het eIF2α-eiwit wordt door dialyse uitgewisseld naar PBS, chemisch gemodificeerd door NHS-LC-biotine en vervolgens door dialyse uitgewisseld naar 50 mM Tris, pH 7,2, 250 mM NaCl, 5 mM DTT. Eiwit wordt gealiquoteerd en opgeslagen bij -80 °C. Quenchoplossing wordt vers bereid en geeft, wanneer toegevoegd aan de reactie, eindconcentraties van 4 nM eIF2α phospho-ser51-antilichaam, 4 nM Eu-1024 gelabeld anti-konijn IgG, 40 nM streptavidine Surelight APC en 15 mM EDTA. Reacties werden uitgevoerd in zwarte 384-well polystyreen platen met laag volume in een eindvolume van 10 μL. Het reactievolume bevat, in eindconcentraties, 10 mM HEPES, 5 mM MgCl₂, 5 μM ATP, 1 mM DTT, 2 mM CHAPS, 40 nM gebiotinyleerd 6-His-eIF2α en 0,4 nM GST-PERK. Te analyseren verbindingen worden opgelost in DMSO tot 1,0 mM en serieel verdund 1–3 met DMSO over 11 verdunningen. Een hoeveelheid van 0,1 μL van elke concentratie wordt overgebracht naar de corresponderende put van een assayplaat. Dit creëert een eindconcentratiebereik van de verbinding van 0,00017 tot 10 μM. GST-PERK-oplossing wordt toegevoegd aan assayplaten die verbindingen bevatten en 30 minuten bij kamertemperatuur voorgeïncubeerd. De reactie wordt geïnitieerd door de toevoeging van ATP- en eIF2α-substraatoplossing. Na 1 uur incubatie wordt de quenchoplossing toegevoegd. De platen worden 2 uur bij kamertemperatuur afgedekt voordat het signaal wordt bepaald. Het resulterende signaal wordt gekwantificeerd op een Viewlux-lezer. Het APC-signaal wordt genormaliseerd naar het europiumsignaal door de gegevens te transformeren via een APC/Eu-berekening. De gegevens voor concentratie-responsiecurven worden uitgezet als %-inhibitie berekend met de data reductieformule 100 × [1 – (U1 – C2)/(C1 – C2)] versus concentratie van de verbinding, waarbij U de onbekende waarde is, C1 de gemiddelde controlewaarde verkregen voor 1% DMSO en C2 de gemiddelde controlewaarde verkregen voor 0,1 M EDTA. Gegevens worden gefit met een curve beschreven door waarbij A de minimale respons is, B de maximale respons, D de hellingsfactor, x de concentratie van de verbinding en C de IC50. De resultaten voor elke verbinding worden geregistreerd als IC50-waarden.

• Cellijnen

  A549 cells

• Concentraties

  0.3 μM

• Incubatietijd

  2 h

• Methode

  Cells were incubated with PERK inhibitor (GSK2606414, compound 38) and then stimulated with thapsigargin. After 2 h, the cells were lysed and analyzed for inhibition of PERK autophosphorylation.

• Dierlijke modellen

  BxPC3 human pancreatic xenograft model

• Doseringen

  ~150 mg/kg

• Toediening

  Oral administration