Crizotinib hydrochloride

PF-2341066 vertoont een vergelijkbare potentie tegen c-Met-fosforylering in mIMCD3-muis- of MDCK-hondenepitheelcellen met IC50 van respectievelijk 5 nM en 20 nM. PF-2341066 toont verbeterde of vergelijkbare activiteit tegen NIH3T3-cellen die zijn gemanipuleerd om c-Met ATP-bindingsplaatsmutanten V1092I of H1094R of de P-loopmutant M1250T tot expressie te brengen, met IC50 van respectievelijk 19 nM, 2 nM en 15 nM, vergeleken met NIH3T3-cellen die de wildtype receptor tot expressie brengen met IC50 van 13 nM. Daarentegen wordt een duidelijke verschuiving in potentie van PF-2341066 waargenomen tegen cellen die zijn gemanipuleerd om c-Met-activeringslusmutanten Y1230C en Y1235D tot expressie te brengen, met IC50 van respectievelijk 127 nM en 92 nM, vergeleken met de wildtype receptor. PF-2341066 voorkomt ook krachtig de fosforylering van c-Met in NCI-H69- en HOP92-cellen, met IC50 van respectievelijk 13 nM en 16 nM, die de endogene c-Met-varianten R988C en T1010I tot expressie brengen. PF-2341066 is >1.000-voudig selectief voor de VEGFR2- en PDGFRβ-RTK's, >250-voudig selectief voor IRK en Lck, en ∼40- tot 60-voudig selectief voor Tie2, TrkA en TrkB, allemaal vergeleken met c-Met. PF-2341066 is 20- tot 30-voudig selectief voor RON- en Axl-RTK's. Daarentegen vertoont PF-2341066 een bijna-equivalente IC50 van 24 nM tegen de nucleofosmine (NPM)-anaplastische lymfoomkinase (ALK) oncogene fusievariant van de ALK RTK die tot expressie wordt gebracht door de KARPAS299 menselijke anaplastische grootcellige lymfoom (ALCL) cellijn. PF-2341066 remt c-Met-afhankelijke neoplastische fenotypes van kankercellen en angiogene fenotypes van endotheelcellen. PF-2341066 onderdrukt de groei van menselijke GTL-16 maagcarcinoomcellen met IC50 van 9,7 nM. PF-2341066 induceert apoptose in GTL-16-cellen met IC50 van 8,4 nM. PF-2341066 remt HGF-gestimuleerde migratie en invasie van menselijke NCI-H441 longcarcinoomcellen met IC50 van respectievelijk 11 nM en 6,1 nM. PF-2341066 remt MDCK-celverspreiding met IC50 van 16 nM. PF-2341066 voorkomt HGF-gestimuleerde c-Met-fosforylering, celoverleving en Matrigel-invasie met IC50 van respectievelijk 11 nM, 14 nM en 35 nM. Bovendien voorkomt PF-2341066 serum-gestimuleerde HMVEC-vertakkende tubulogenese (vorming van vasculaire buisjes) in fibrinegels.[4]

In het GTL-16-model toont PF-2341066 het vermogen om een duidelijke regressie van grote gevestigde tumoren (>600 mm3) te veroorzaken in zowel de behandelingscohorten van 50 mg/kg/dag als 75 mg/kg/dag, met een afname van 60% in het gemiddelde tumorvolume over het toedieningsschema van 43 dagen. In een andere studie toont PF-2341066 het vermogen om de tumorgroei van GTL-16 volledig te remmen gedurende >3 maanden, waarbij slechts 1 van de 12 muizen een significante toename van de tumorgroei vertoonde over het behandelingsschema van 3 maanden bij 50 mg/kg/dag. In het NCI-H441 NSCLC-model wordt een afname van 43% in het gemiddelde tumorvolume waargenomen bij 50 mg/kg/dag tijdens de 38-daagse PF-2341066-toedieningscyclus. In het Caki-1 RCC-model wordt een afname van 53% in het gemiddelde tumorvolume waargenomen, geassocieerd met een afname van het volume van elke tumor met ten minste 30% bij 50 mg/kg/dag tijdens de 33-daagse PF-2341066-toedieningscyclus. PF-2341066 toont ook een bijna-volledige preventie van de groei van gevestigde tumoren bij 50 mg/kg/dag in de U87MG glioblastoom- of PC-3 prostaatcarcinoom-xenograftmodellen, met respectievelijk 97% of 84% remming op de laatste studiedag. Daarentegen remt PF-2341066 p.o. gegeven bij 50 mg/kg/dag de tumorgroei niet significant in het MDA-MB-231 borstcarcinoommodel of het DLD-1 coloncarcinoommodel. Een significante dosisafhankelijke reductie van CD31-positieve endotheelcellen wordt waargenomen bij 12,5 mg/kg/dag, 25 mg/kg/dag en 50 mg/kg/dag in GTL-16-tumoren, wat aangeeft dat remming van MVD een dosisafhankelijke correlatie vertoont met antitumorale werkzaamheid. PF-2341066 vertoont een significante dosisafhankelijke reductie van menselijke VEGFA- en IL-8-plasmaspiegels in zowel de GTL-16- als U87MG-modellen. Een duidelijke remming van gefosforyleerde c-Met-, Akt-, Erk-, PLCλ1- en STAT5-niveaus wordt waargenomen in GTL-16-tumoren na orale toediening van PF-2341066.[4]

• Cellulaire kinasefosforylering ELISA-assays

  Cellen worden uitgezaaid in 96-well platen in media aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en na 24 uur overgebracht naar serumvrije media [met 0,04% runderserumalbumine (BSA)]. In experimenten die ligandafhankelijke RTK-fosforylering onderzoeken, worden overeenkomstige groeifactoren tot 20 minuten toegevoegd. Na incubatie van cellen met PF-2341066 gedurende 1 uur en/of geschikte liganden gedurende de aangegeven tijden, worden cellen eenmaal gewassen met HBSS aangevuld met 1 mM Na₃VO₄, en worden eiwitlysaten gegenereerd uit cellen. Vervolgens wordt de fosforylering van geselecteerde proteïnekinasen beoordeeld met een sandwich ELISA-methode met behulp van specifieke vangantistoffen die worden gebruikt om 96-well platen te coaten en een detectieantistof die specifiek is voor gefosforyleerde tyrosineresiduen. Antilichaam-gecoate platen worden (a) 's nachts bij 4°C geïncubeerd in aanwezigheid van eiwitlysaten; (b) zeven keer gewassen in 1% Tween 20 in PBS; (c) geïncubeerd in een mierikswortelperoxidase-geconjugeerd anti-totaal-fosfotyrosine (PY-20) antilichaam (1:500) gedurende 30 minuten; (d) opnieuw zeven keer gewassen; (e) geïncubeerd in 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidineperoxidasesubstraat om een colorimetrische reactie te initiëren die wordt gestopt door toevoeging van 0,09 N H₂SO₄; en (f) gemeten op absorptie bij 450 nm met behulp van een spectrofotometer.

• Cellijnen

  GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells

• Concentraties

  0-256 nM

• Incubatietijd

  1 h

• Methode

  Cells including GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells are seeded in 96-well plates in media supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and transferred to serum-free media [with 0.04% bovine serum albumin (BSA)] after 24 hours. In experiments investigating ligand-dependent RTK phosphorylation, corresponding growth factors are added for up to 20 minutes. After incubation of cells with PF-2341066 for 1 hour and/or appropriate ligands for the designated times, cells are washed once with HBSS supplemented with 1 mM Na₃VO₄, and protein lysates are generated from cells. Subsequently, phosphorylation of selected protein kinases is assessed by a sandwich ELISA method using specific capture antibodies used to coat 96-well plates and a detection antibody specific for phosphorylated tyrosine residues. Antibody-coated plates are (a) incubated in the presence of protein lysates at 4 °C overnight; (b) washed seven times in 1% Tween 20 in PBS; (c) incubated in a horseradish peroxidase–conjugated anti–total-phosphotyrosine (PY-20) antibody (1:500) for 30 min; (d) washed seven times again; (e) incubated in 3,3^′,5,5^′-tetramethyl benzidine peroxidase substrate to initiate a colorimetric reaction that is stopped by adding 0.09 N H₂SO₄; and (f) measured for absorbance in 450 nm using a spectrophotometer.

• Dierlijke modellen

  Female or male nu/nu mice bearing NCI-H441,or DLD-1, or MDA-MB-231

• Doseringen

  12.5 mg/kg/day, 25 mg/kg/day, and 50 mg/kg/day

• Toediening

  p.o.