BX-795

BX-795 blokkeert effectief de PDK1-activiteit in PC-3-cellen, zoals aangetoond door hun vermogen om de fosforylering van S6K1, Akt, PKCδ en GSK3β te blokkeren. Deze verbinding remt krachtig de groei van tumorcellen op plastic met IC50 van 1,6, 1,4 en 1,9 μM voor respectievelijk MDA-468-, HCT-116- en MiaPaca-cellen. In zachte agar vertoont het een hogere groeiremming met IC50 van 0,72 en 0,25 μM voor respectievelijk MDA-468- en PC-3-cellen. [1]

Bovendien blokkeert deze chemische stof, als een remmer van de TBK1/IKKɛ, de TBK1- en IKKε-gemedieerde activering van IRF3 en de productie van IFN-β. [2]

In fysiologische responsen van bloedplaatjes produceert deze verbinding een remmend effect op 2-MeSADP-geïnduceerde of collageen-geïnduceerde aggregatie, ATP-secretie en tromboxaanproductie. [3]

BX-795, een TBK-1- en PDK-1-remmer, remt ook de eiwittranslatie van HSV.

• Kinase assays

  PDK1 wordt getest in een directe kinase assay en een gekoppelde assay die PDK1- en PtdIns-3,4-P2-gemedieerde activering van AKT2 meet. Voor de gekoppelde assay bevatte het uiteindelijke assaymengsel (60 μL): 15 mM MOPS, pH 7,2, 1 mg/mL bovien serumalbumine, 18 mM β-glycerolfosfaat, 0,7 mM dithiothreitol, 3 mM EGTA, 10 mM MgOAc, 7,5 μM ATP, 0,2 μCi [γ-³³P]ATP, 7,5 μM gebiotinyleerd peptidesubstraat (biotine-ARRRDGGGAQPFRPRAATF), 0,5 μL PtdIns-3,4-P2-bevattende fosfolipidevesikels, 60 pg gezuiverde recombinante menselijke PDK1 en 172 ng gezuiverde recombinante menselijke AKT2. Na incubatie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur wordt het biotine-gelabelde peptide uit 10 μl van het assaymengsel op streptavidine-gecoate SPA-parels vastgelegd, en productvorming wordt gemeten door scintillatieproximiteit in een Wallac MicroBeta-teller. Het gevormde product is evenredig met de incubatietijd en met de hoeveelheid toegevoegde PDK1 en inactieve AKT2. Deze verbinding wordt op suboptimale niveaus toegevoegd, zodat de assay gevoelig remmers van AKT2-activering kon detecteren, evenals directe remmers van PDK1 of AKT2. Om de PDK1-activiteit direct te meten, bevatte het uiteindelijke assaymengsel (60 μL) 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 0,1 mM EDTA, 0,1% β-mercaptoethanol, 1 mg/mL bovien serumalbumine, 10 mM MgOAc, 10 μM ATP, 0,2 μCi [γ-³³P]ATP, 7,5 μM substraatpeptide (H2N-ARRRGVTTKTFCGT) en 60 ng gezuiverde recombinante menselijke PDK1. Na 4 uur bij kamertemperatuur voegen we 25 mM EDTA toe en spotten we een deel van het reactiemengsel op Whatman P81 fosfocellulosepapier. Het filtreerpapier wordt driemaal gewassen met 0,75% fosforzuur en eenmaal met aceton. Na drogen wordt het filtergebonden gelabelde peptide gekwantificeerd met behulp van een Fuji fosforimager.

• Cellijnen

  MDA-468, PC-3, HCT-116 and MiaPaca cells

• Concentraties

  ~10 μM

• Incubatietijd

  72 hours

• Methode

  Cells seeded at a low density (1,500–3,000 cells/well, 0.1 mL/well, 96-well plates) are incubated overnight. Compound treatments are made by adding 10 μL/well of this compound in 1% dimethyl sulfoxide and growth medium (final concentration of dimethyl sulfoxide, 0.1%), followed by brief shaking. Treated cells are incubated for 72 hours, and viability is measured by the addition of 10 μL of the metabolic dye WST-1. The WST-1 signal is read in a plate reader at 450 nm, and a no cell, or zero time cell, background is subtracted to calculate the net signal. Results are reported as the average ± S.E. of two or more replicates.