SB203580 (Adezmapimod)

Adezmapimod (SB203580) remt de IL-2-geïnduceerde proliferatie van primaire menselijke T-cellen, muizen CT6 T-cellen of BAF F7 B-cellen met een IC50 van 3–5 μm. Het remt ook de IL-2-geïnduceerde p70S6 kinase-activering, hoewel de benodigde concentratie iets hoger is met een IC50 boven 10 μm. Deze verbinding remt de activiteit van PDK1 op een dosisafhankelijke manier met een IC50 in het bereik van 3–10 μm. [1] Het remt p38-MAPK-stimulatie van MAPKAPK2 met een IC50 van ongeveer 0,07 μM, terwijl de totale SAPK/JNK-activiteit wordt geremd met een IC50 van 3–10 μM. Bij hogere concentraties activeert het de ERK-route, wat vervolgens de NF-κB transcriptionele activiteit versterkt. [2] Het induceert ook autofagie in menselijke hepatocellulaire carcinoom (HCC) cellen. [3]

Adezmapimod (SB203580) beschermt varkensmyocard tegen ischemische schade in een in vivo model. [4]Het is ook effectief in het voorkomen en behandelen van de ziekte in het MRL/lpr muizenmodel van systemische lupus erythematosus (SLE). [5]

• Cellulaire receptorkinase fosforyleringsanalyse

  4 μg schaap anti-PKBα wordt 's nachts (of 1,5 uur) geïmmobiliseerd op 25 μL proteïne G-Sepharose en gewassen in Buffer A (50 mm Tris, pH 7,5, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 0,5 mm Na₃VO₄, 0,1% β-mercapto-ethanol, 1% Triton X-100, 50 mm natriumfluoride, 5 mm natriumpyrofosfaat, 0,1 mm fenylmethylsulfonylfluoride, 1 μg/mL pepstatine, leupeptine en 1 μm microcystine). De geïmmobiliseerde anti-PKB wordt vervolgens geïncubeerd met 0,5 ml lysaat (van 5 × 10⁶ cellen) gedurende 1,5 uur en driemaal gewassen in 0,5 ml Buffer A aangevuld met 0,5 m NaCl, tweemaal in 0,5 ml Buffer B (50 mm Tris-HCl, pH 7,5, 0,03% (w/v) Brij-35, 0,1 mm EGTA en 0,1% β-mercapto-ethanol), en tweemaal met 100 μl assay verdunningsbuffer; 5× assay verdunningsbuffer is 100 mm MOPS, pH 7,2, 125 mm β-glycerofosfaat, 25 mm EGTA, 5 mm natriumorthovanadaat, 5 mm DTT. Aan het PKB-enzym immuuncomplex wordt 10 μL assay verdunningsbuffer, 40 μm proteïne kinase A-remmer peptide, 100 μm PKB-specifiek substraatpeptide en 10 μCi [γ-³²P]ATP toegevoegd, allemaal opgemaakt in assay verdunningsbuffer. De reactie wordt 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd onder schudden, waarna monsters worden gepulst en 40 μL van het reactievolume wordt overgebracht naar een andere buis waaraan 20 μL 40% trichloorazijnzuur wordt toegevoegd om de reactie te stoppen. Dit wordt gemengd en 5 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd, en 40 μL wordt overgebracht op P81 fosfocellulosepapier en 30 seconden laten binden. Het P81-stuk wordt driemaal gewassen in 0,75% fosforzuur en vervolgens in aceton bij kamertemperatuur. γ-³²P-incorporatie wordt vervolgens gemeten door scintillatietelling.

• Cellijnen

  CT6 cell , BA/F3 F7 cell

• Concentraties

  0–30 μM

• Incubatietijd

  1 hour

• Methode

  CT6 cell and BA/F3 F7 cell are rested by washing three times in RPMI and culturing overnight in RPMI, 5% fetal calf serum in the absence of growth factor, antibiotics, or β-mercaptoethanol supplements. 2–5 × 10⁶ rested CT6 cells are resuspended in 2 mL of RPMI, 5% fetal calf serum and preincubated with Adezmapimod (SB203580) or vehicle control as indicated in figure legends. Cells are then stimulated with 20 ng/ml recombinant human IL-2 for 5 minutes at 37  °C and pelleted in a minifuge for 30 seconds, medium is aspirated, and the pellet is lysed in the appropriate buffer. BA/F3 cells stably expressing deletion mutants of IL-2 receptor β chain are maintained in glutamine containing RPMI further supplemented with 5% fetal calf serum and 0.2 μg/mL G418. The cells are then washed extensively, rested overnight, and washed again before activating with IL-2; such cell preparations are >90% T cells. Cellular proliferation assays are performed by measurement of [³H]thymidine incorporation.

• Dierlijke modellen

  Systemic lupus erythematosus (SLE) are established in female MRL/lpr mice and female C57BL/6 mice

• Doseringen

  0.1 M/day

• Toediening

  Orally administered