ZSTK474

ZSTK474 bij 1 μM vermindert de PI3K-activiteit potent met 4,7% van het controleniveau, terwijl LY2194002 de activiteit slechts tot 44,6% van de controle vermindert. Deze verbinding remt de activiteiten van recombinante p110β, -γ, en -δ met IC50 van respectievelijk 17 nM, 53 nM en 6 nM. Het vertoont een potente antiproliferatieve activiteit tegen een panel van 39 menselijke kankercellijnen met een gemiddelde GI50 van 0,32 μM, effectiever dan die van LY294002 of wortmannine met een gemiddelde GI50 van respectievelijk 7,4 μM of 10 μM. Deze chemische behandeling bij 1 μM blokkeert membraanruffeling en de aanmaak van PIP3 geïnduceerd door bloedplaatjesafgeleide groeifactor in muizen embryonale fibroblasten (MEF's). Het induceert bij 10 μM apoptose in OVCAR3-cellen en induceert volledige G1-fase-arrestatie maar geen apoptose in A549-cellen. Deze verbindingbehandeling bij 0,5 μM vermindert significant het niveau van gefosforyleerde Akt en GSK-3β, evenals de cycline D1-eiwitexpressie. Het remt ook de fosforylering van andere stroomafwaartse signaalcomponenten die betrokken zijn bij het reguleren van celproliferatie, waaronder FKHRL1, FKHR, TSC-2, mTOR en p70S6K, op een dosisafhankelijke manier. [1] Deze chemische stof remt mTOR niet bij 0,1 μM, en zelfs bij een concentratie van 100 μM remt het de mTOR-activiteit minder dan 40%. [2] Het blokkeert VEGF-geïnduceerde celmigratie en buisvorming in menselijke navelstrengendotheelcellen (HUVEC's) en remt de expressie van HIF-1α en secretie van VEGF in RXF-631L-cellen, vertoont een potente in vitro antiangiogene activiteit. [3] Deze verbindingbehandeling remt de productie van IFNγ en IL-17 in concanavaline A-geactiveerde T-cellen en remt de proliferatie en PGE(2)-productie door fibroblastachtige synoviale cellen (FLS). [6]

• Remming van PI3K-activiteit

  A549-cellen worden gelyseerd in een buffer die 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA en 1% Igepal CA-630 bevat. De lysaten worden gedurende 10 minuten bij 20.000 g en 4 °C gecentrifugeerd en de supernatanten worden gebruikt als celysaat (eiwit = 2-4 mg/mL). Om PI3K te immunoprecipiteren, worden 200 μL celysaat geïncubeerd met anti-p85 polyklonaal antilichaam en proteïne G-agarose (5 μL). PI3Kα, PI3Kβ en PI3Kδ kunnen worden geïmmunoprecipiteerd door het anti-p85 polyklonaal antilichaam. Agarosekorrels die immunoprecipitaten bevatten, worden tweemaal gewassen met buffer A (20 mM Tris-HCl bij pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA en 1% Igepal CA-630), eenmaal met buffer B (500 mM LiCl en 100 mM Tris-HCl bij pH 7,5), eenmaal met gedestilleerd water en eenmaal met buffer C (100 mM NaCl en 20 mM Tris-HCl bij pH 7,5). Immunoprecipitaten worden gesuspendeerd in 20 μL buffer C die fosfatidylinositol van 200 μg/mL bevat. Het mengsel wordt 5 minuten bij 25 °C voor-geïncubeerd met toenemende concentraties van deze verbinding. [γ-³²P]ATP (2 μCi per testmengsel; eindconcentratie, 20 μM) en MgCl₂ (eindconcentratie, 20 mM) worden toegevoegd om de reactie te starten. Het reactiemengsel wordt gedurende 20 minuten bij 25 °C geïncubeerd. Gefosforyleerde producten van fosfatidylinositol worden gescheiden door dunnelaagchromatografie en gevisualiseerd door autoradiografie. Het fosfatidylinositol-3-fosfaatgebied wordt van de plaat geschraapt en de radioactiviteit wordt ook gemeten met vloeistofscintillatiespectroscopie. Het remmingsniveau voor deze chemische stof wordt bepaald als het percentage ³²P-tellingen per minuut verkregen zonder deze verbinding.

• Cellijnen

  MCF-7, HT-29, HCT-116, OVCAR3, A549, et al.

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Incubatietijd

  48 hours

• Methode

  Cells are exposed to increasing concentrations of ZSTK474 for 48 hours. The inhibition of cell proliferation is assessed by measuring changes in total cellular protein by use of a sulforhodamine B assay. Apoptosis is assessed by chromatin condensation or by flow cytometry. For chromatin condensation assay, cells are stained with Hoechst 33342 and examined by fluorescence microscopy. Morphologic changes induced by this compound, such as the condensation of chromatin, are indicative of apoptosis. For flow cytometry analysis, cells are harvested, washed with ice-cold PBS, and fixed in 70% ethanol. Cells are then washed twice with ice-cold PBS again, treated with RNase A (500 μg/mL) at 37 °C for 1 hour, and stained with propidium iodide (25 μg/mL). The DNA content of the cells is analyzed with a flow cytometer.

• Dierlijke modellen

  Male BDF1 mice injected subcutaneously with B16F10 cells, and female BALB/c nude mice inoculated subcutaneously with A549, PC-3, or WiDr cells

• Doseringen

  ~400 mg/kg/day

• Toediening

  Orally