Tandutinib (MLN518)

Tandutinib (MLN518) heeft weinig activiteit tegen EGFR, FGFR, KDR, InsR, Src, Abl, PKC, PKA en MAPKs. Het remt IL-3-onafhankelijke celgroei en FLT3-ITD-autofosforylering met een IC50 van 10-100 nM. Deze verbinding remt ook de proliferatie van menselijke leukemie Ba/F3-cellen die FLT3-ITD-mutaties bevatten met IC50-waarden van 10-30 nM, en de FLT3-ITD-positieve Molm-13- en Molm-14-cellen met een IC50 van 10 nM. In FLT3-ITD-positieve Molm-14-cellen, maar niet in de FLT3-ITD-negatieve THP-1-cellen, leidt Tandutinib-behandeling tot significante apoptose van respectievelijk 51% en 78% na 24 en 96 uur, als gevolg van specifieke FLT3-remming. [1] Het remt bij voorkeur de groei van blastkolonies van FLT3 ITD-positieve patiënten met AML, vergeleken met ITD-negatieve patiënten, zonder de kolonieformatie door normale menselijke voorlopercellen te beïnvloeden. [2]

Orale toediening van Tandutinib (MLN518) in een dosis van 60 mg/kg tweemaal daags verhoogt de overleving significant bij muizen die Ba/F3-cellen dragen die de W51 FLT3-ITD-mutant tot expressie brengen, en geeft een significante vermindering van de mortaliteit in een muizenbeenmergtransplantatiemodel. [1] Behandeling met deze verbinding in een dosis van 180 mg/kg tweemaal daags heeft milde toxiciteit voor normale hematopoëse, echter, het is een dosis waarbij het effectief is bij de behandeling van FLT3 ITD-positieve leukemie bij muizen. [2]

• Op cellen gebaseerde receptorautofosforyleringsassays

  Autofosforylering van PDGFR-familiekinaseassays zijn celgebaseerde enzym-gekoppelde immunosorbent (ELISA) assays die CHO-cellen gebruiken die wildtype PDGFRβ, chimere proteïne PDGFRβ/c-Kit en PDGFRβ/Flt3 tot expressie brengen, die de extracellulaire en transmembraandomeinen van PDGFRβ en het cytoplasmatische domein van c-Kit en Flt-3 bevatten. Cellen worden tot confluentie gekweekt in 96-well microtiterplaten onder standaard weefselkweekcondities, gevolgd door serumdeprivatie gedurende 16 uur. Kortom, rustende cellen worden gedurende 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd met toenemende concentraties Tandutinib (MLN518), gevolgd door de toevoeging van 8 nM PDGF-BB gedurende 10 minuten. Cellen worden gelyseerd in 100 mM Tris, pH 7,5, 750 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 10 mM natriumpyrofosfaat, 50 mM NaF, 10 μg/mL leupeptine, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 1 mM natriumvanadaat, en het lysaat wordt geklaard door centrifugatie bij 15.000 g gedurende 5 minuten. Geklaarde lysaten worden overgebracht naar een tweede microtiterplaat waarin de putjes eerder waren bekleed met 500 ng/putje van 1B5B11 anti-PDGFRβ mAb en vervolgens gedurende 2 uur bij kamertemperatuur werden geïncubeerd. Na drie keer wassen met bindingbuffer (0,3% gelatine, 25 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,01% Tween 20), wordt 250 ng/mL van konijnen polyklonale anti-fosfotyrosine-antilichaam toegevoegd en worden platen gedurende 60 minuten bij 37 °C geïncubeerd. Vervolgens wordt elk putje drie keer gewassen met bindingbuffer en geïncubeerd met 1 μg/mL mierikswortelperoxidase-geconjugeerd anti-konijnenantilichaam bij 37 °C gedurende 60 minuten. Putjes worden gewassen voordat 2,2 wordt toegevoegd

• Cellijnen

  Ba/F3, Molm-13, Molm-14, HL60, AML193, KG-1, KG-1a, THP-1, and RS4;11

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~30 μM

• Incubatietijd

  ~7 days

• Methode

  Cells are exposed to increasing concentrations of Tandutinib (MLN518) (0.004-30 μM). They are grown for 3-7 days in tissue culture, and viable cells, determined by Trypan blue dye exclusion, are counted. At daily intervals, cells are harvested, washed, and resuspended in 100 uL binding buffer containing 10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, and 2.5 mM CaCl₂. Annexin V-FITC (100 ng) and propidium iodide (250 ng) are added to the cell suspension followed by incubation at room temperature for 15 minutes. Flow cytometry is performed immediately after staining on a FACSort flow cytometer with excitation at 488 nm. Fluorescence of annexin V-FITC and DNA propidium iodide staining are measured at 515 nm and 585 nm, respectively.

• Dierlijke modellen

  Female athymic nude (nu/nu) mice injected with Ba/F3 cells expressing W51 FLT3-ITD mutant

• Doseringen

  40-120 mg/kg/day

• Toediening

  Orally by gavage