Pemetrexed Disodium (LY231514)

TS-activiteit wordt getest met een spectrofotometrische methode, waarbij de toename in absorptie bij 340 nm wordt gevolgd als gevolg van de vorming van het product, 7,8-dihydrofolaat. De assaybuffer bevat 50 mM N-tris[hydroxymethyljmethyl-2-aminoethaansulfonzuur, 25 mM MgCl₂, 6,5 mM formaldehyde, 1 mM EDTA en 75 mM 2-mercaptoethanol, pH 7,4. De concentraties van deoxyuridylaatmonofosfaat, 6R-MTHF en hIS zijn respectievelijk 100 μM, 30 μM en 30 nM (1,7 milli-eenheden/mL). Bij de 6R-MTHF-concentratie worden een ongeremde reactie en zes concentraties remmer getest. K_{i app}-waarden worden bepaald door de gegevens aan de Morrison-vergelijking aan te passen met behulp van niet-lineaire regressieanalyse met behulp van het programma ENZFITTER. K_i-waarden worden berekend met behulp van de vergelijking: K_{i app} = K_i(1 + [S]/K_m), waarbij [S] gelijk is aan 30 μM en K_m gelijk is aan 3 μM. DHFR-activiteit wordt spectrofotometrisch getest door het verdwijnen van de substraten NADPH en 7,8-dihydrofolaat bij 340 nm te volgen. De reactie vindt plaats bij 25°C in 0,5 mL 50 mM kaliumfosfaatbuffer, die 150 mM KCl en 10 nM 2-mercaptoethanol, pH 7,5, en 14 nM (0,34 milli-eenheid/mL) DHFR bevat. De NADPH-concentratie is 10 μM en 7,8-dihydrofolaat varieert bij 5, 10 of 15 μM. Bij elke 7,8-dihydrofolaatconcentratie worden een ongeremde reactie en zeven concentraties remmer getest. Het ENZFITI'ER microcomputerprogramma wordt gebruikt om K_{i app}-waarden te verkrijgen door de gegevens aan de Morrison-vergelijking aan te passen met niet-lineaire regressieanalyse. K_{i app} = K_i(1 + [S]/K_m), waarbij [S] gelijk is aan de gebruikte concentratie van 7,8-dihydrofolaat en K_m van 7,8-dihydrofolaat gelijk is aan 0,15 μM. GARFT-activiteit wordt spectrofotometrisch getest door de toename van de absorptie als gevolg van de vorming van het product 5,8-dideazafolaat bij 295 nm te volgen. Het reactieoplosmiddel bevat 75 mM HEPES, 20% glycerol en 50 mM a-thioglycerol, pH 7,5, bij 25°C. De concentraties van substraten en enzym gebruikt zijn 10 μM α,β-glycinamideribonucleotide, 0-10 μM 10-formyl-5,8-dideazafolic acid en 10 nM (1,9 milli-eenheden/mL) GARFT. K_i-waarden worden berekend met behulp van het Enzyme Mechanism-programma van de Beckman DU640 spectrofotometer, dat niet-lineaire regressieanalyse gebruikt om gegevens aan de Michaelis-Menten-vergelijking voor competitieve remming aan te passen.

CCRF-CEM leukemia, GC3/C1 colon carcinoma, and HCT-8 ileocecal carcinoma cells.

0-30 μM

72 hours

Dose-response curves are generated to determine the concentration required for 50% inhibition of growth (IC50). Pemetrexed disodium is dissolved initially in DMSO at a concentration of 4 mg/mL and further diluted with cell culture medium to the desired concentration. CCRF-CEM leukemia cells in complete medium are added to 24-well Cluster plates in a total volume of 2.0 mL. This compound at various concentrations are added to duplicate wells so that the final volume of DMSO is 0.5%. The plates are incubated for 72 hour at 37 °C in an atmosphere of 5% CO₂ in air. At the end of the incubation, cell numbers are determined on a ZBI Coulter counter. For several studies, IC50s are determined for each compound in the presence of either 300 μM AICA, 5 μM thymidine, 100 μM hypoxanthine, or combination of 5 μM hymidine plus 100 μM hypoxanthine. For adherent tumor cells, a modification of the original MTT colorimetric assay is used to measure cell cytotoxicity. The human tumor cells are seeded in 100 μL assay medium/well in 96-well flat-bottomed tissue culture plates. The assay medium contains folic acid-free RPMI 1640 supplemented with 10% FCS and either 2 nM folinic acid or 2.3 μM folic acid as the sole folate source. Well 1A is left blank. Stock solutions of antifolates are prepared in Dulbecco's PBS at 1 mg/mL, and a series of 2-fold dilutions are subsequently made in PBS. Ten-μL aliquots of each concentration are added to triplicate wells. Plates are incubated for 72 hours at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO₂-in-air. MTT is dissolved in PBS at 5 mg/mL, 10 μL of stock MTF solution are added to each well of an assay, and the plates are incubated at 37 °C for 2 additional hours. Following incubation, 100 μL of DMSO are added to each well. After thorough formazan solubilization, the plates are read on a Dynatech MR600 reader, using a test wavelength of 570 nm and a reference wavelength of 630 nm. The IC50 is determined as the concentration of drug required to inhibit cell growth by 50% compared to an untreated controls.

EMT-6 mammary carcinoma, the human HCT 116 colon carcinoma, and the human H460 non-small cell lung carcinoma are injected s.c. into the nude mice.

100 mg/kg or 150 mg/kg

Administered via i.p.