Palomid 529 (P529)

Palomid 529 (P529) remt de proliferatie en verhoogt de apoptose van endotheelcellen, waardoor zowel VEGF-gestuurde als bFGF-gestuurde proliferatie van endotheelcellen wordt geremd met IC50 van respectievelijk 20 nM en 30 nM. Het behoudt het vermogen om apoptose van endotheelcellen te induceren en vermindert de VEGF-A-gestuurde fosforylering van pAktS473, pGSK3βS9 en pS6. Deze verbinding voorkomt echter noch gefosforyleerd mitogeen-geactiveerd proteïnekinase (pMAPK) noch pAktT308 zo krachtig als pAktS473.[1] Het vermindert niet alleen de proliferatieve respons in de ischemische retina, maar verbetert ook de organisatie en structuur van de vaten die zich vormen. [1] P529 vertoont een krachtige antiproliferatieve activiteit in het NCI-60-cellijnenpanel, met een groeiremmende 50 (GI50) <35 μM. Bovendien verbetert het aanzienlijk het antiproliferatieve effect van straling in prostaatkankercellen (PC-3), wat leidt tot een concentratieafhankelijke groei-inhibitie op PC-3-cellen. Doses van 2 en 7μM resulteerden in respectievelijk 30 en 60% groei-inhibitie. Het remt de stralingsgeïnduceerde p-Akt-activering en verlaagt de Bcl-2/Bax-ratio in PC-3. Deze verbinding remt niet alleen de stralingsgeïnduceerde overexpressie van Id-1 en VEGF, maar reguleert ook de stralingsgeïnduceerde MMP-2 en MMP-9 naar beneden. [2]

Palomid 529 (P529) vertoont een dosisafhankelijke remming van de Ad-VEGF-A-gestuurde angiogenese na behandeling. Het remt de groei van C6V10-glioomtumoren in naakte muizen na i.p.-dosering en vermindert AktS473- maar niet AktT308-signalering. Deze verbinding remt ook tumorgroei, angiogenese en vasculaire permeabiliteit. [1] Behandeling van PC-3-tumordragende muizen ermee verminderde de tumorgroei tot 57,1% in vergelijking met controles. [2] Het is een effectieve onderdrukker van Müller-celproliferatie, gliacarlittekenvorming en fotoreceptorceldood in een konijnenmodel van netvliesloslating (RD). [3] Palomid 529 onderdrukt significant de groei van Brca1-deficiënte tumoren in muizen door remming van zowel Akt- als mTOR-signalering. [4]

• Oestrogeenreceptorbindingsassays

  De eiwitten worden geproduceerd met konijnenreticulocytlysaat. De hoeveelheid templaat die in elke reactie wordt gebruikt, wordt empirisch bepaald en de expressie wordt gecontroleerd in parallelle reacties waarbij [³⁵S]methionine wordt ingebouwd in de receptor, gevolgd door gelelektroforese en blootstelling aan film. Bindingsreacties van de oestrogeenreceptoren (ER) en Palomid 529 (P529) worden uitgevoerd in eindvolumes van 100 mL in TEG-buffer [10 mM Tris (pH 7.5), 1.5 mM EDTA, 10% glycerol]. In vitro getranscribeerd-vertaald receptor (5 μL) wordt gebruikt in elke bindingsreactie in aanwezigheid van 0.5 nM [³H]estradiol (E2). Deze verbinding wordt routinematig getest van 10⁻¹¹ tot 10⁻⁶ M en verdund in ethanol. De reacties worden 's nachts bij 4 °C geïncubeerd en gebonden E2 wordt gekwantificeerd door 200 mL dextran-beklede houtskool toe te voegen. Na 15 minuten rotatie bij 4 °C worden de buizen 10 minuten gecentrifugeerd en wordt 150 mL van het supernatant toegevoegd aan 5 mL scintillatiemengsel voor bepaling van cpm door vloeistofscintillatietelling. De maximale binding wordt bepaald door gebonden E2 te concurreren met alleen het ethanolvehikel. Controles voor achtergrond zijn opgenomen in elk experiment met 5 mL ongeprogrammeerd konijnenreticulocytlysaat. Deze waarde, typisch 10% tot 15% van de maximale tellingen, wordt van alle waarden afgetrokken. De gegevens worden uitgezet en K_i-waarden worden berekend. Experimenten worden ten minste driemaal in duplo uitgevoerd.

• Cellijnen

  Human umbilical vascular endothelial cells (HUVEC)

• Concentraties

  ~20 μM

• Incubatietijd

  48 hours

• Methode

  Human umbilical vascular endothelial cells (HUVEC) are used. The proliferation assay is carried out by seeding the HUVECs in 96-well plates at a density of 1,000 per well in complete medium. Following a 24-hour plating period, the cells are starved for 24 hours in 0.5% serum before being treated with Palomid 529 (P529) in the presence of 10 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF) or VEGF in complete medium. After 48 hours, cell number is determined using a colorimetric method. The results are expressed as the percentage of the maximal bFGF or VEGF response in the absence of this compound. Nonproliferating endothelial cells are assayed by growing HUVECs to quiescence in 96-well plates and treating with it for 48 hours. Initially, 5,000 cells per well are seeded and confluence is achieved the next day. The plates are incubated for another 24 hours to ensure growth arrest before treatment with the same compound.