Nutlin-3

Nutlin-3 remt potent de MDM2-p53 interactie, wat leidt tot de activering van de p53-route. Deze verbinding behandeling induceert de expressie van MDM2 en p21, en vertoont een potente antiproliferatieve activiteit met een IC50 van ~1.5 μM, alleen in cellen met wild-type p53 zoals HCT116, RKO en SJSA-1, maar niet in de mutant p53-cellijnen SW480 en MDA-MB-435. In SJSA-1-cellen induceert deze verbinding behandeling bij 10 μM gedurende 48 uur significant caspase-afhankelijke cel Apoptosis met ~45%. Hoewel het ook de groei en levensvatbaarheid van menselijke huid (1043SK) en muizenembryo (NIH/3T3) remt met een IC50 van respectievelijk 2.2 μM en 1.3 μM, blijven cellen levensvatbaar 1 week na behandeling, zelfs bij 10 μM van deze chemische stof, in tegenstelling tot de SJSA-1-cellen waarbij de levensvatbaarheid verloren ging bij 3 μM van deze chemische behandeling. [1] Het induceert niet de fosforylering van p53 op belangrijke serine-residuen en vertoont geen verschil in hun sequentie-specifieke DNA-binding en het vermogen om p53 targetgenen te transactiveren vergeleken met gefosforyleerd p53 geïnduceerd door de genotoxische geneesmiddelen doxorubicine, wat aantoont dat fosforylering van p53 op belangrijke serines overbodig is voor transcriptionele activering en Apoptosis. [2] Hoewel het minder efficiënt bindt aan MDMX dan aan MDM2, kan deze verbinding de MDMX–p53 interactie blokkeren en de p53-route induceren in retinoblastoomcellen (Weri1) met een IC50 van 0.7 μM. [3] Deze chemische stof bij 30 μM verstoort ook de endogene p73-HDM2 interactie en verbetert de stabiliteit en pro-Apoptosis activiteiten van p73, wat leidt tot de dosisafhankelijke celgroeiremming en Apoptosis-inductie in cellen zonder wild-type p53. [4]

Orale toediening van Nutlin-3 bij 200 mg/kg tweemaal daags gedurende 3 weken remt de tumorgroei van SJAS-1 xenografts significant met 90%, vergelijkbaar met het effect van doxorubicinebehandeling met 81% remming van de tumorgroei. [1]

• Biacore-studie

  Competitie-assay wordt uitgevoerd op een Biacore S51. Een Serie S Sensor chip CM5 wordt gebruikt voor de immobilisatie van een PentaHis-antilichaam voor de capture van de His-tagged p53. Het niveau van capture is ~200 responsunits (1 responsunit komt overeen met 1 pg eiwit per mm²). De concentratie MDM2-eiwit wordt constant gehouden op 300 nM. Nutlin-3 wordt opgelost in DMSO bij 10 mM en verder verdund om een concentratieserie van deze verbinding te maken in elk MDM2-testmonster. De assay wordt uitgevoerd bij 25 °C in loopbuffer (10 mM Hepes, 0.15 M NaCl, 2% DMSO). MDM2-p53 binding in aanwezigheid van deze chemische stof wordt berekend als een percentage van de binding in afwezigheid ervan en IC50 wordt berekend

• Cellijnen

  HCT116, RKO, SJSA-1, SW480, and MDA-MB-435

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~ 30 μM

• Incubatietijd

  8, 24, and 48 hours

• Methode

  Cells are exposed to various concentrations of Nutlin-3 for 8, 24 and 48 hours. The transcriptional levels of p21 and MDM2 genes are analyzed by real-time PCR, and protein levels by western blotting. Cell viability is measured by the MTT assay. Cell apoptosis is determined by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labeling (TUNEL) staining with flow cytometry and fluorescence microscopy.

• Dierlijke modellen

  Athymic female nude mice (Nu/Nu-nuBR) injected subcutaneously with SJSA-1 cells

• Doseringen

  200 mg/kg

• Toediening

  Orally, twice a day