Flavopiridol (Alvocidib, HMR-1275)

Voor de CDK1/cycline B1 kinase-test bestaan de kinase-reacties uit 100 ng van baculovirus-uitgedrukt GST-CDK1/cycline B1 (menselijk) complex, 1 μg histone HI, 0,2 μCi [γ-³³P]ATP, 25 μM ATP in 50 μL kinasebuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 0,5 mM DTT). Voor de CDK2/cycline E kinase-test bestaan de kinase-reacties uit 5 ng van baculovirus-uitgedrukt GST-CDK2/cycline E (menselijk) complex, 0,5 μg GST-RB fusie-eiwit (aminozuren 776-928 van retinoblastoma-eiwit), 0,2 μCi [γ-³³P]ATP, 25 μM ATP in 50 μL kinasebuffer (50 mM Hepes, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM DTT). Voor de CDK4/cycline D1 kinase-test bestaan de kinase-reacties uit 150 ng van baculovirus-uitgedrukt GST-CDK4/cycline D1 (menselijk), 280 ng van Stag-cycline D1, 0,5 μg GST-RB fusie-eiwit (aminozuren 776-928 van retinoblastoma-eiwit), 0,2 μCi [γ-³³P]ATP, 25 μM ATP in 50 μL kinasebuffer (50 mM Hepes, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM DTT). Reacties worden gedurende 45 minuten voor CDK1 en CDK2, of 1 uur voor CDK4 bij 30 °C geïncubeerd en gestopt door de toevoeging van koud trichloorazijnzuur (TCA) tot een uiteindelijke concentratie van 15%. TCA-precipitaten worden verzameld op GF/C unifilterplaten met behulp van een Filtermate universele oogster en de filters worden gekwantificeerd met behulp van een TopCount 96-wells vloeistofscintillatieteller. Flavopiridol (Alvocidib) wordt opgelost in 10 mM dimethylformamide (DMF) en geëvalueerd bij zes concentraties, elk in drievoud. De uiteindelijke concentratie DMF in de test = 2%. IC50-waarden worden afgeleid door niet-lineaire regressieanalyse en hebben een variatiecoëfficiënt = 16%. Om de activiteit op CDK6 te testen, wordt een filterbindingsassay opgezet. Het volgende wordt gecombineerd in het reactiemengsel: 2 μL CDK6 (0,7 mg/μL), 5 μL histone H1 (6 mg/mL), 14 μL kinasebuffer (60 mM β-glycerofosfaat, 30 mM p-nitrofenylfosfaat, 25 mM MOPS (pH 7,0), 5 mM EGTA, 15 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,1 mM Na-vanadaat), 3 μL toenemende concentraties van deze verbinding verdund in 50% DMSO, en 6 μL ³³P-ATP (1 mCi/mL) in niet-radioactief ATP bij 90 μM concentratie (uiteindelijke concentratie: 15 μM). De test wordt gestart door de toevoeging van ³³P-ATP. De reactie wordt gedurende 20 minuten bij 30°C geïncubeerd. Een aliquot van 25 μL van het supernatant wordt vervolgens aangebracht op Whatman P81 fosfocellulosepapier. Filters worden 5 keer gewassen met 1% fosforzuuroplossing. Natte filters worden geteld in aanwezigheid van 1 mL scintillatievloeistof. CDK9-activiteit wordt gemeten met behulp van 50 nM recombinant CDK9/cycline T in 50 mM HEPES pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, 150 μM RNA polymerase CDT-peptide en 80 μM ATP. CDK7-test wordt uitgevoerd in dezelfde buffer met behulp van 37 nM gezuiverde kinase in aanwezigheid van 200 μM ATP en 10 μM myelinebindend eiwit als substraat. De potentie ervan ten opzichte van CDK9 en CDK7 wordt bepaald met behulp van ofwel een sterk anionenwisselaar (Dowex 1-X8 hars, formiaatvorm)-gebaseerde test of een scintillatie nabijheidsassay. IC50-waarden worden berekend uit de dosis-respons-curven.

MCF-7, LNCAP, PC3, HCT116, CACO-2, A549, HL60, K562 cells and et al.

Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

72 hours

Cells are exposed to various concentrations of Flavopiridol (Alvocidib) for 72 hours, at which time the tetrazolium dye, MTS in combination with phenazine methosulfate, is added. After 3 hours, the absorbency is measured at 492 nm, which is proportional to the number of viable cells. The results are expressed as IC50 values. For cell cycle analysis, cells are fixed in paraformaldehyde and ethanol, washed, resuspended in a staining solution of TdT enzyme and FITC-dUTP, washed, stained with PI following RNase treatment, and then analyzed by flow cytometry.

Female Balb/c×DBA/2J F1 mice inoculated ip with P388 ascites leukemic cells, and Balb/c nu/nu nude mice subcutaneous implanted with A2780, Br-cycE, or A431 cells

~7.5 mg/kg/day

Injection i.p.