SKI-606 (Bosutinib)

Bosutinib is selectief voor Src ten opzichte van niet-Src-familiekinasen met een IC50 van 1,2 nM en remt potent Src-afhankelijke celproliferatie met een IC50 van 100 nM. [1] Deze verbinding remt significant de proliferatie van Bcr-Abl-positieve leukemiecellijnen KU812, K562 en MEG-01, maar niet van Molt-4, HL-60, Ramos en andere leukemiecellijnen, met een IC50 van respectievelijk 5 nM, 20 nM en 20 nM, krachtiger dan die van STI-571. Net als STI-571 vertoont het antiproliferatieve activiteit tegen de Abl-MLV-getransformeerde fibroblasten met een IC50 van 90 nM. Deze chemische stof ablateert tyrosinefosforylering van Bcr-Abl en STAT5 in CML-cellen en van v-Abl uitgedrukt in fibroblasten bij een concentratie van respectievelijk ~50 nM, 10-25 nM en 200 nM, wat leidt tot de Bcr-Abl-stroomafwaartse signaalremming van Lyn/Hck-fosforylering. [2] Hoewel het de proliferatie en overleving van borstkankercellen niet kan remmen, vermindert het significant de beweeglijkheid en invasie van borstkankercellen met een IC50 van ~250 nM, betrokken bij een toename van cel-tot-celadhesie en membraanlokalisatie van β-catenine. [3]

Bosutinib (60 mg/kg/dag) is actief tegen Src-getransformeerde fibroblastxenografts en HT29-xenografts in naakte muizen met een T/C van respectievelijk 18% en 30%. [1] Orale toediening van deze verbinding gedurende 5 dagen onderdrukt significant de groei van K562-tumoren bij muizen op een dosisafhankelijke manier, waarbij de grote tumoren werden uitgeroeid bij een dosis van 100 mg/kg en tumorvrij waren bij 150 mg/kg zonder duidelijke toxiciteit. [2] Omdat het inactief is tegen Colo205-xenografts in naakte muizen bij 50 mg/kg tweemaal daags, is deze chemische dosering van 75 mg/kg tweemaal daags nodig tegen Colo205-xenografts, en het verhogen van de dosis van deze verbinding heeft geen extra voordeel, in tegenstelling tot het significante dosisafhankelijke vermogen tegen HT29-xenografts. [4]

• De Src- en Abl-kinaseassays

  De Src-kinaseactiviteit wordt gemeten in een ELISA-formaat. Src (3 eenheden/reactie), reactiebuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, 0,5 mM Na₃VO₄) en cdc2-substraatpeptide worden toegevoegd aan verschillende concentraties van Bosutinib en geïncubeerd bij 30 °C gedurende 10 minuten. De reactie wordt gestart door de toevoeging van ATP tot een uiteindelijke concentratie van 100 μM, geïncubeerd bij 30 °C gedurende 1 uur en gestopt door toevoeging van EDTA. Instructies van de fabrikant worden gevolgd voor verdere stappen. De Abl-kinaseassay wordt uitgevoerd in een DELFIA solid-phase europium-gebaseerde detectieassayformaat. Gebiotinyleerd peptide (2 μM) wordt gebonden aan met streptavidine gecoate microtitratieplaten gedurende 1,5 uur in 1 mg/mL ovalbumine in PBS. De platen worden 1 uur gewassen met PBS/0,1% Tween 80, gevolgd door een PBS-wasbeurt. De kinasereactie wordt gedurende 1 uur bij 30°C geïncubeerd. Abl-kinase (10 eenheden) wordt gemengd met 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 80 μM EGTA, 100 μM ATP, 0,5 mM Na₃VO₄, 1% DMSO, 1 mM HEPES (pH 7,0), 200 μg/mL ovalbumine en verschillende concentraties van deze verbinding. De reactie wordt gestopt met EDTA in een uiteindelijke concentratie van 50 mM. De reactie wordt gemonitord met Eu-gelabelde fosfotyrosine-antilichaam en DELFIA-versterkingsoplossing.

• Cellijnen

  Abl-MLV, Rat 2, KU812, K562, and MEG-01 cells

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~1 μM

• Incubatietijd

  72 hours

• Methode

  Cells are exposed to various concentrations of Bosutinib for 72 hours. Anchorage-independent proliferation of Abl-MLV-transformed fibroblasts is measured in 96-well ultra-low binding plates treated with Sigmacote to block residual cell attachment. Cell proliferation is measured with MTS or Cell-Glo. For the determination of cell cycle or cell death, cells are prepared for FACS analysis in the CycleTest Plus DNA reagent kit and analyzed on a fluorescence-activated cell sorter flow cytometer.

• Dierlijke modellen

  Nude female mice injected with K562 cells

• Doseringen

  ~150 mg/kg/day

• Toediening

  Oral gavage