3-Methyladenine (3-MA)

De lichte voorkeur voor Vps34-preventie door 3-Methyladenine (3-MA) komt waarschijnlijk voort uit een hydrofobe ring die specifiek is voor Vps34, die de 3-methylgroep van deze verbinding omgeeft. [1] Er is gemeld dat het kankerceldood veroorzaakt onder zowel normale als uithongeringsomstandigheden, en het zou ook celmigratie en -invasie kunnen onderdrukken, onafhankelijk van zijn vermogen om Autophagy te remmen, wat impliceert dat het functies bezit die verder gaan dan Autophagy-onderdrukking. Deze verbinding veroorzaakt caspasedependente celdood die onafhankelijk is van Autophagy-inhibitie. Behandeling met 5 mM ervan vermindert het percentage glucose-uitgehongerde HeLa-cellen dat GFP-LC3-puntjes vertoont tot 23%. De niveaus van LC3-I nemen toe en de niveaus van LC3-II nemen af tussen 12 en 48 uur in cellen die met 3-MA worden behandeld. Conversie van LC3-I naar LC3-II wordt onderdrukt door de verbinding. Behandeling van HeLa-cellen ermee bij 2,5 mM of 5 mM gedurende één dag heeft geen invloed op de cellevensvatbaarheid, terwijl behandeling met 10 mM gedurende één dag een afname van 25,0% in cellevensvatbaarheid veroorzaakt. Behandeling van cellen met 2,5, 5 of 10 mM gedurende twee dagen veroorzaakt respectievelijk een afname van 11,5%, 38,0% en 79,4% in levensvatbaarheid. Het vermindert de cellevensvatbaarheid op een tijd- en dosisafhankelijke manier, en verkort de duur van nocodazole-geïnduceerde-prometafase-arrestatie aanzienlijk. [2] Onderdrukking van Autophagy door 3-MA remt SU11274-geïnduceerde celdood. [3] Langdurige behandeling ermee (tot 9 uur) induceert significante LC3 I naar II conversie in wild-type MEF's. Langdurige behandeling met 3-MA, maar niet met wortmannin, verhoogt GFP-LC3-punctering/aggregatie aanzienlijk. De geïnduceerde LC3-conversie en vrije GFP-vrijgave zijn ATG7-afhankelijk. Behandeling ermee leidt tot een duidelijke toename van het p62-proteïneniveau. De verbinding verhoogt het p62-niveau zelfs in Atg5−/− MEF's, evenals in cellen met DOX-gemedieerde deletie van ATG5. Het remt klasse I en klasse III PI3K in verschillende temporele patronen. De geïnduceerde LC3 I naar LC3 II conversie is dramatisch gecompromitteerd in Tsc2−/− cellen in vergelijking met wild-type cellen. Deze verbinding verstoort de anti-autophagische functie van het mTOR complex 1. [4]

3-Methyladenine (3-MA) blokkeert Autophagy door zijn effect op klasse III phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K). Behandeling met deze verbinding verandert de mate van bloeding niet in vergelijking met de subarachnoïdale bloeding (SAH) groep. De voorbehandeling ervan verergert de neurologische symptomen aanzienlijk in vergelijking met de SAH + voertuig groep. Autophagy is verminderd wanneer het wordt toegepast. Omgekeerd is gesplitst caspase-3 sterk opgereguleerd in de SAH + 3-MA groep. In lijn met de opregulatie van gesplitst caspase-3 expressie, is het aantal TUNEL-positieve cellen in de rechter cortex significant verhoogd in de SAH + 3-MA groep in vergelijking met de SAH + voertuig groep. [5]

• Eiwitafbraaktest

  HeLa-cellen worden gedurende 24 uur radiogemarkeerd met 0,05 mCi/mL l-[U- ¹⁴C]valine. Aan het einde van de markeringsperiode worden de cellen driemaal gespoeld met PBS. Cellen worden gedurende de aangegeven tijden geïncubeerd in ofwel volledig medium of EBSS met of zonder de aanwezigheid van 10 mM 3-Methyladenine (3-MA).

• Cellijnen

  HeLa cell line

• Concentraties

  1-10 mM

• Incubatietijd

  24, 48 or 72 hours

• Methode

  After treatment with 3-Methyladenine (3-MA), cell (such as HeLa cell) viability is determined by a trypan blue exclusion assay. Briefly, both adherent and floating cells are collected and suspended in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) at a final density of 1-2 × 10⁶/mL. An equal volume of 0.4% trypan blue solution (w/v, in PBS) is added to the cell suspension and mixed thoroughly. After incubation at room temperature for 3 min, cell counting is performed using a hemacytometer.

• Dierlijke modellen

  Adult male Sprague–Dawley rats weighing 300-350 g

• Doseringen

  400 nM

• Toediening

  Intracerebral ventricular